关键词:
嗜盐微生物
生物质能
运动发酵单胞菌
解淀粉慢生芽孢杆菌
Tn5转座系统
摘要:
运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)因具有突出的代谢能力而成为产燃料乙醇的优良宿主菌之一,但是该菌对纤维素发酵水解液或生物柴油废弃物中产生的盐比较敏感(如NaCl等),在以这些生物质为原料的发酵过程中,菌体生长受到极大抑制,使乙醇产率大幅度下降。为获得耐盐表型改善的运动发酵单胞菌,本研究从嗜盐微生物菌株筛选出发,并尝试将其耐盐功能候选基因应用在运动发酵单胞菌中,以获得耐盐运动发酵单胞菌工程菌株。主要结论如下:(1)从烟台渤海盐泥沉积物,以高浓度NaCl作为筛选压力,并通过一系列多相分类鉴定学方法,分离鉴定1株嗜盐菌Lentibacillus属新种,命名为Lentibacillus amyloliquefaciens,模式菌为LAM0015T。该菌株的16S rDNA序列提交在NCBI,登录号为KJ002449。该模式菌种分别保藏在中国农业微生物菌种保藏中心(ACCC 06401)和日本菌种保藏中心(JCM 19838)。(2)完成了*** LAM0015T的全基因组测序(NCBI登录号为CP013862),其基因组大小3,858,520 bp,G+C含量为42.12%,预测编码基因共2496个,ncRNA基因共169个。经分析发现,含有大量的天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘油、甜菜碱等渗透压平衡相关的编码基因,为进一步揭示嗜盐机制和发掘耐盐等功能基因奠定了坚实基础,同时为其他功能基因的应用提供重要依据。(3)从菌株*** LAM0015T的基因组中分别克隆了甜菜碱和四氢嘧啶合成等耐盐候选基因;同时构建了该菌株的基因组克隆文库,通过盐胁迫筛选,获得了若干潜在耐盐功能基因,例如ABC运输体透性酶蛋白基因、TetR家族转录调控因子基因、青霉素结合蛋白基因等,经验证这些基因对宿主大肠杆菌的耐盐表型有一定程度的改善。(4)基于Tn5转座系统构建*** ZM4的随机突变文库,筛选获得1株耐盐表型改善的突变菌株,命名为*** ZMT2(保藏号CGMCC No.11888)。通过染色体步移的方法,确定突变株中转座子插入位点在ZMO1122(himA)中。目前没有ZMO1122与盐耐受性相关的报道,为进一步验证该基因与盐耐受性的关系,利用基因敲除技术将野生型菌株的该基因敲除,获得敲除菌株***Δ1122。(5)发酵评估数据表明:突变菌株ZMT2在盐胁迫情况下具有较高的乙醇产率、较高的生长速率及较快的葡萄糖利用速率。低盐(小于1.5%NaCl)培养时,突变株与野生株生长无明显差异。低糖1.5%NaCl胁迫发酵10 h,ZMT2几乎将葡萄糖全部利用,而Δ1122和ZM4分别只利用了总葡萄糖的67.15%和69.70%,20 h后才利用完;高糖1.5%NaCl发酵40 h,ZMT2和Δ1122的OD600分别是ZM4的1.62倍和1.74倍,葡萄糖的利用分别是ZM4的1.46倍和1.54倍,乙醇产量是ZM4的2.21倍和2.35倍。含2%NaCl低糖培养18 h时,ZMT2和Δ1122的OD600分别是ZM4的1.15倍和1.13倍,而高糖培养26 h时,分别是ZM4的1.17倍和1.13倍。(6)实时荧光定量PCR结果显示:ZMO1122在ZMT2和Δ1122中无论有无盐胁迫下均无相对表达,表明该基因已被敲除,ZM4在低糖1.5%NaCl培养下的ZMO1122(3.18±0.88)的相对表达量是0%(0.56±0.17),1%(0.55±0.39)和2%(0.54±0.28)的约6倍。在一定盐浓度范围内,pdc的相对表达量变化随盐浓度的增加而降低,adhB的相对表达量的变化随盐浓度的增加而升高。PDC和ADHB蛋白酶活的变化趋势与相应基因的变化趋势一致。NADH/NAD+检测结果表明,较低的比值有助于适应盐胁迫,而在无盐胁迫时,较高的比值可能与突变株中平衡himA基因功能缺失有关。