关键词： Minisci反应   可见光催化   不对称合成   手性Lewis酸催化   自由基  

摘要： Minisci反应是由意大利化学家Francesco Minisci于上个世纪70年代所提出的一类经由自由基历程来实现缺电子氮杂芳烃的烷基化、芳基化以及酰基化反应。这一合成方法的实现极大地推动了氮杂芳烃类底物的官能化衍生,鉴于该类结构在一些生物活性分子和药物合成中占据着重要作用,因此在有机合成方法学里一直备受关注。 传统的Minisci反应以烷基羧酸为自由基前体,Ag2+/S2O82-体系作为氧化剂,在过量质子酸同时加热的条件下进行,较为苛刻的反应条件限制了底物范围的拓展。 随着体系的不断优化和发展,更多自由基前体如羧酸、羧酸衍生物、硼酸、卤代烷等均能在简单温和的条件下实现Minisci烷基化反应。然而,自由基还是局限于简单的烷基自由基,其他具有一定活性的自由基如α-胺烷基自由基因其易过氧化的特性使得直到近几年才有课题组采用活性的氨基酸酯作为反应前体,以Lewis酸及可见光协同在温和的条件下实现了具有一定底物广度的氮杂芳环C-H活化α-胺烷基化反应,同时通过手性Lewis酸的引入也实现了该反应历程的不对称化。 有机可见光催化是自2008年后迅猛发展的一类新型绿色有机催化方法,它借助光子的高能量激发反应物,该过程通常由反应体系中加入的光催化剂通过单电子转移或能量转移的方式来完成,当底物或反应中存在的某些中间物质具有光敏活性时,光催化剂也可以被舍去。近几年借由光催化体系实现的Minisci反应层出不穷,大多都采用了光催化剂被激发后活化底物的策略,因为仅需光照便能获得能量引发反应,反应条件得到了很大改善,同时底物兼容性也进一步增强。 基于目前的光催化Minisci反应,我们考虑从底物性质入手在更简单的反应条件下去完成氮杂芳环的α-胺烷基化,同时保持在已知相关报道中表现出的反应活性和底物兼容性。最终,我们以氨基酸的活性酯作为底物,以商品化的手性磷酸作为催化剂,在合适波长的可见光照射条件下,实现了一系列氮杂芳环底物的不对称α-胺烷基化。 通过控制实验得到的结果与底物的光学性质表征,我们发现反应可能经历双自由基偶联历程得到产物,并且是依靠氮杂环底物的活化来引发而非通过传统的自由基源生成自由基再对氮杂环进行进攻。酸催化剂是反应的关键,它与底物之间的多个氢键作用既对底物进行了活化同时又保持反应在具有良好的对映选择性环境中进行。

关键词： [4+2]环加成   四氢喹啉   邻氨基苄氯   不对称合成   串联反应  

摘要： 四氢喹啉化合物是有机合成中最重要的氮杂环化合物之一,广泛存在于天然产物和药物分子中。四氢喹啉化合物通常具有良好的生物活性,如抗菌、抗炎、抗肿瘤等。由于四氢喹啉化合物的重要性,其高效合成仍是有机合成的热点之一,是一项非常有意义的研究课题。氮杂邻亚甲基苯醌作为有机合成中重要的1,4-偶极子,具有寿命短、高活性和多功能等特点,广泛应用于有机化学、材料化学和生物科学等领域,可以与不同的亲电试剂参与环加成反应构建五、六、七元等氮杂环化合物。本论文主要围绕邻氨基苄氯在不同条件下生成氮杂邻亚甲基苯醌的1,4-偶极子,与呋喃、双环烯烃和吲哚等亲核试剂发生分子间[4+2]环加成反应高效构建四氢喹啉稠环化合物及其转化应用展开研究。同时,发展不对称反应构建系列含多个手性中心的四氢喹啉化合物。本文分为六个部分:第一部分,围绕四氢喹啉的核心骨架,介绍了目前四氢喹啉化合物的合成策略,包括分子内胺化,过渡金属催化喹啉氢化,C-H键活化,Diels-Alder反应,扩环等策略。邻氨基苄氯作为生成氮杂邻亚甲基苯醌1,4-偶极子的重要前体,可以参与环加成反应高效构建四氢喹啉化合物。因此,本部分还综述了邻氨基苄氯在[4+2]环加成反应构建四氢喹啉化合物的最新进展。第二部分,研究了无金属参与的邻氨基苄氯和呋喃通过分子间[4+2]环加成反应选择性地生成二氢呋喃并[3,2-b]四氢喹啉和四氢呋喃并[2,3-b:4,5-b']二喹啉两类化合物的方法。以良好的产率和高区域选择性得到产物,该反应兼容多种官能团。通过控制实验和核磁跟踪实验表明:邻氨基苄氯即时产生的氮杂邻亚甲基苯醌偶极子和呋喃参与[4+2]环加成反应是一个协同过程,而不是分步进行的机理。第三部分,发展了Cu2O和2,9-二甲基-1,10-菲咯啉为催化剂,催化邻氨基苄氯与氧杂双环烯烃通过[4+2]环加成反应构建具有多个立体中心的环氧苯并[b]吖啶化合物的方法。控制实验表明:邻氨基苄氯在Cu2O和2,9-二甲基-1,10-菲咯啉催化下形成氮杂邻亚甲基苯醌偶极子是一个自由基反应的过程。铜在反应中不仅加速形成氮杂邻亚甲基苯醌,同时也加速[4+2]环加成反应。所得的环氧苯并[b]吖啶化合物可以通过化学转化,合成多种四氢喹啉核心骨架化合物。初步的不对称反应尝试可以获得10%ee的对映选择性,为进一步实现其不对称环加成反应提供实验依据。第四部分,发展了Cu（OAc）2/1,10-菲咯啉催化两分子邻氨基苄氯与N-甲基吲哚三组分形式的[4+2]环加成反应,以良好的产率和高非对映选择性合成了C3季碳的吲哚啉并[2,3-b]四氢喹啉化合物。中间体分离的机理研究表明:该反应是经过吲哚分子间两次取代反应和分子内环化的历程。该反应底物范围广、官能团兼容性好、可克级量制备,且原子经济性高。第五部分,实现了以邻氨基苄氯、2,3-二氢呋喃和芳基三氟甲磺酸酯的三组分反应,通过钯和轴手性双膦配体催化Heck反应/[4+2]环加成的串联反应,合成了系列含三个手性中心的四氢呋喃并[2,3-b]四氢喹啉化合物。该反应可以取得良好的产率和优秀的对映选择性、非对映选择性和区域选择性（≥90% ee,20:1 dr）。该串联反应的底物范围广、官能团兼容性好、可克级量制备,并可以应用于修饰药物分子,可以高产率和高的对映选择性和非对映选择性引入含四氢呋喃并[2,3-b]四氢喹啉的手性片段。第六部分,实现了钯和轴手性双膦配体催化氯代醛肟、2,3-二氢呋喃和芳基三氟甲磺酸酯三组分的反应,通过Heck反应/[3+2]环加成串联策略,合成了系列含三个手性中心的四氢呋喃并[3,2-d]异噁唑啉化合物。该反应可以以良好的产率和高对映选择性和非对映选择性得到产物（≥90% ee,3:1 to 20:1 dr）。该策略也能快速高对映选择性和非对映选择性地引入含三个手性中心的四氢呋喃并[3,2-d]异噁唑啉片段（≥90% ee,3:1 to 20:1 dr）。

关键词： 不对称合成   1,2-碳双亲核试剂   螺环氧化吲哚   螺环戊烷氧化吲哚   吲哚生物碱骨架  

摘要： 吲哚骨架作为广泛存在于生物活性杂环和天然产物中的重要药骨架,其具有抗癌,抗HIV,抗微生物,抗氧化等多样的生物活性。此外,在利血平和丝裂霉素C等几种生物碱中,吲哚结构也被认为是其主要的活性成分。此外,舒马曲坦、他达拉非、氟伐他汀和利扎曲坦等知名药物的分子结构都是基于吲哚骨架的。因此,在过去的十年里,含吲哚化合物的合成研究与生物活性的研究越来越受到化学家的关注。但在吲哚类生物碱中,常常因为其毒性过高或者活性不足的各类问题,难以直接作为临床药物,往往需要结构的改造与修饰。同时,不对称合成在药物合成中作为构建与修饰骨架常用方法之一,其具有便捷经济等特点,在合成具有生物活性的化合物方面有巨大潜力。而在有机合成中,碳双亲核试剂是有机合成的重要构件,在碳环化合物的构建中有着广泛的应用。其中,1,2-碳双亲核试剂的还较少被人们发现并应用于作为合成子,根据文献查阅也仅有2例。因此,我们将该双亲核试剂与吲哚骨架相互结合,开发了2-（2-氧代吲哚-3-丙二腈）底物,尝试与2-硝基烯丙基乙酸酯进行[2+3]不对称环化反应,以合成具有潜在药物活性的吲哚骨架。同时通过立体选择性的控制,得到单一空间构型的吲哚类化合物。以此为目的,我们进行了以下工作:合成了不同取代与不同保护基的2-（2-氧代吲哚-3-丙二腈）,在取得了不同种类的产物的同时,环化反应表现出单一的化学和区域选择性,控制了产物其对映选择性。与此我们提出了一种新的Michael加成/SN2反应机制来避免“反Baldwin”环化反应。这种高度立体选择性的策略为合成一系列新的含有三个立体中心的螺环戊烷氧吲哚衍生物提供了一条简便的合成路线。为合成药物所需的螺环戊烷氧化吲哚提供了参考方法,也为吲哚骨架类药物增效减毒的结构修饰提供了思路。

摘要： This project develops new organometallic frameworks, to target the asymmetric transfer hydrogenation and hydrosilylation of ketones, aiming for enhanced activity and substrate scope relative to current state-of-the-art. The anticancer activity of some of the complexes were assessed against a human colorectal adenocarcinoma cell line. The first chapter of this work discusses relevant research published, identifying key areas that possess limitations. Chapter 2 describes the synthesis of tethered ruthenium(II) half-sandwich complexes, constructing structures bearing chirality within the tether; a prospect not yet explored. The key to this design is the stereocentre, situated at the benzylic position. A bulky substituent, methyl, isopropyl or t-butyl, emanates hoping to control the tether coordination. The tether was designed to influence the metal-centred configuration and thus the configuration of the ATH product. Although configurational exchange was seen over time, the complexes yieldedproducts in modest ee. Chapter 3 describes the synthesis of manganese(I) half-sandwich frameworks, aiming to incorporate a stereocentre into the tether so the approach of the substrate to the complex during hydrosilylation would be influenced by the steric bulk of the tether. Irradiation of the achiral tethered complexes outlined in this chapter showed great promise, hence if the reaction conditions can be tuned accordingly, the frameworks can still be considered as good target complexes to be used in hydrosilylation. Chapter 4 describes exploration towards the synthesis of a polymer-supported ruthenium(II) half-sandwich complex, analogous to those developed in Chapter 2, anticipated to be capable of the asymmetric transfer hydrogenation of ketones. Frameworks in the literature incorporate supports through amino, sulfonamide or phenyl groups within the ligand, allowing for cheaper and less toxic reaction conditions, and advantageous recyclability, without loss of enantioselectivity.

关键词： 中药   生物碱   手性四氢异喹啉   不对称氢化   铱催化  

摘要： 延胡索、黄连、防己等中药中均含有手性四氢异喹啉类生物碱化合物,在止痛、抗炎等疾病的临床治疗方面发挥着重要作用。为满足中药创新药物研究需要,以中药中手性四氢异喹啉类化合物为先导化合物高效率制备和绿色环保催化不对称合成方法,尤其催化不对称氢化更引人注目。尽管利用不对称氢化制备手性四氢异喹啉已获得不少进展,但真正应用于中药此类效应成分或天然产物合成、结构修饰改造的催化体系仍然十分匮乏。究其原因主要有:(1)中药主要效应成分结构复杂,目前研究多集中于具有较小位阻(烷基、苯基等)取代基的结构;(2)异喹啉类底物碱性和氮原子的配位能力较强,往往会使得催化剂失活而无法获得高催化活性和高对映选择性。为将不对称氢化技术更精确地应用到中药活性成分的合成以及结构修饰改造,主要开展了两部分研究工作:(1)手性1-大位阻取代四氢异喹啉类生物碱的合成手性1-取代四氢异喹啉作为优势类药骨架,是诸多中药效应分子、化学合成药的重要砌块。现有催化体系大都只适用于C1位上位阻效应较小的烷基取代基和芳香基等,针对叔丁基、叔戊基和金刚烷基等取代的底物则未见报道。本研究针对性地合成了27个1-大位阻(叔丁基、叔戊基、金刚烷基等)取代二氢异喹啉类化合物,并采用Ir/t-Bu-axJoisphos配合物作催化剂(1 mol%),40%HBr aq.(0.1 eq.)为添加剂,在50℃和50atm氢气下不对称催化氢化上述底物,以较高的产率和对映选择性合成了27种(S)-1-取代四氢异喹啉衍生物(85%-95%yield,74%-99%ee)。同时,将此催化体系应用到番荔枝宁衍生物(S)-二甲基番荔枝宁的合成中(85%yield,96%ee)。在高效合成中药效应成分的改造领域开辟了一条新的途径。(2)手性3-取代四氢异喹啉类生物碱的合成手性3-取代四氢异喹啉在药学领域具有很好的应用前景,不同于1-取代四氢异喹啉,手性3-取代四氢异喹啉制备方法单一。由于碱性和结构中氮原子的配位能力较强,通过3-取代异喹啉盐的不对称氢化反应制备手性3-取代四氢异喹啉具有很大的挑战性,制备方法的缺乏严重制约了这类骨架化合物的研究。本研究设计合成了19个3-芳基异喹啉,以3-芳基异喹啉盐酸盐作为底物,采用Ph-ax-Josiphos与金属铱形成的溴桥双核阳离子配合物作催化剂,丙酮为溶剂,在30℃和20 atm氢气条件下,成功地合成了19种手性3-芳基四氢异喹啉衍生物,产率(88%-96%),对映选择性(68%-97%ee)。同时,对3-苯基异喹啉进行了克级规模氢化反应,分离产率93%,对映选择性达96%ee。本课题开发了一种能有效避免底物N原子(或产物N原子)与催化剂形成配位而造成催化剂失效的催化体系,进一步拓展了手性3-芳基四氢异喹啉生物碱库,为含有此类化合物中药效应成分的深入研究提供了重要技术参考。

关键词： 氢烷基化   原子经济性   缬氨酸衍生物   协同催化   丝氨酸以及半胱氨酸衍生物   立体发散性  

摘要： 结构多样的手性α-氨基酸在众多研究领域,如多肽合成、配体设计、药物开发以及生命科学等有不可替代的地位。我们课题组一直致力于非天然氨基酸的催化不对称合成。为进一步丰富非天然氨基酸不对称合成的方法学,本论文主要开展了如下研究工作: 1.我们以Pd/PHOX络合物作为催化剂,实现了azlactones的不对称氢烷基化反应,得到了一系列含有连续叔碳以及季碳手性中心的烯丙基取代非天然氨基酸。此方法具有以下三个优势:(a)原子经济性,与传统产生p-allyl-Pd中间体的方式(Pd与烯丙醇或者预先官能团化的烯丙醇氧化加成得到)不同,我们采用了Pd-H对1,3-dienes插入生成p-allyl-Pd中间体的策略,避免了废弃物的产生;(b)底物适用范围广,不仅小位阻取代的azlactones如丙氨酸、亮氨酸以及苯丙氨酸等衍生物可以在我们体系中平稳的进行反应,极具挑战性的缬氨酸衍生的大位阻azlactone也能以中等的收率(54%)以及优秀的立体选择性(>20:1 dr和97%ee)得到目标产物;(c)合成方法具有一定的实用性,反应在放大到克级规模后仍然能保持优秀的收率以及对映选择性,同时所得产物可以方便的转化为手性氨基醇以及环状非天然氨基酸。 2.利用双金属Cu/Ir-协同催化策略,合成了一系列含有两个连续手性中心的丝氨酸以及半胱氨酸衍生物。在本项研究工作中,我们采用2-oxazoline-以及2-thiazoline-4-carboxylates作为丝氨酸以及半胱氨酸的前体,避免了使用含有非保护羟基以及巯基的亚甲氨叶立德(羟基以及巯基作为潜在的亲核位点可能会对反应产生不利影响)。反应操作简单,底物适用范围广泛,通过改变两种手性催化剂的组合,可以立体发散性的得到含有两个连续手性中心产物的所有四个光学异构体。

摘要： In general, nitroolefins are convenient structures as Michael acceptors. To make it clear for this work, attack of a sulfur-containing nucleophile to a nitroolefin forms a C-S bond and opening the double bond would create a nucleophilic center on the nitroolefin which leads to the formation of a new C-C bond. In this study, asymmetric organocatalytic sulfa-Michael addition of 1,4-dithiane-2,5-diol to trans-β-nitrostyrene derivatives was carried out which yielded polyfunctional tetrahydrothiophenes that have the potential of biological activities, building blocks for chiral ligands and benefit in the synthesis of gold nanoparticles. In the first part, several quinine-based and 2-aminoDMAP-based bifunctional organocatalysts and different conditions were tested to find the optimized conditions for the reaction generating relatively high yield and stereoselectivity in a shorter time. Then, derivatization studies were performed by using diverse trans-β-nitrostyrenes in the optimized conditions determined previously. Increase in stereoselectivity was reached up to 70 % ee and 96:4 dr for the tetrahydrothiophene derivatives.

关键词： 镍催化   不对称合成   膦中心手性   烯丙基化   膦氢化  

摘要： 膦中心手性化合物是一类非常重要的有机化合物,其在有机催化、医药合成、材料科学以及高分子科学等领域都有着十分广泛的应用。近些年来,随着有机合成领域不对称催化研究的蓬勃发展,膦中心手性化合物的种类和功能的多样性也被不断发掘。相较于碳手性和轴手性等常规配体,膦中心手性化合物具有更加接近反应中心的特点,因而其在参与催化不对称反应过程中可能具有更为独特的活性和选择性。第1章主要介绍了膦中心手性化合物的研究意义及合成策略。相较于膦中心手性化合物在药物合成、有机催化等多个领域所发挥的重要价值,研究人员对于其合成策略的研究则显得十分匮乏。本论文的这一部分对文献中已经报道的膦中心手性化合物的构建策略进行了总结,其中重点突出和比较了过渡金属催化的不对称合成膦中心手性化合物的相关研究。第2章介绍了我们小组近期所报道的利用两种外消旋原料二级膦氧化物和烯丙基酯的反应高效的构建手性烯丙基膦氧化物的相关研究。我们从化学性质稳定、易合成的二级膦氧化物出发,同时利用另一种十分常见的烯丙基醋酸酯作为烯丙基源,在Ni(COD)2/(S,S)-BDPP的催化体系下,通过动态动力学不对称转化(DYKAT)的方式实现了手性三级烯丙基膦氧化物的合成。该例镍催化的二级膦氧化物的不对称烯丙基化反应的成功实现,意味着相对廉价的金属镍也可参与到催化不对称合成膦中心手性化合物的反应当中,为镍催化膦中心手性化合物的合成提供了重要的参考。该部分内容通过对反应体系的监测和跟踪,直观的对比了动力学拆分(KR)和动态动力学不对称转化(DYKAT)两种不同的反应模式。深入研究后我们发现,体系中催化剂的resting state是二价镍物种,其在二级膦氧化物的消旋化过程中起到了至关重要的作用。第3章所介绍的工作为镍催化炔的不对称膦氢化反应。反应首先利用清洁的还原剂苯基硅烷实现了二级膦氧化物到二级膦氢的高效合成,而且所还原得到的二级膦氢可以直接用于后续的催化反应,很好的解决了二级膦氢制备和纯化过程中的易氧化问题。此外,通过镍催化得到的手性三价烯基膦化合物可以进行多样性的衍生化,例如通过后续不同亲电试剂的加入可以分别合成手性的膦硫化物、膦硼烷、膦氧化物、膦硒化物、亚膦酰胺以及季铵盐等,它们在有机小分子催化及相转移催化剂方面都有着潜在的应用价值。此外,三价膦化合物也可以直接用作配体,合成多种手性过渡金属络合物,展现了其强大的应用前景。而且,产物中的双键也可作为分子修饰的另一个重要支点,例如,手性膦硫化合物可以很好的与多种亲核试剂分别合成P-P、P-N及P-S类双齿配体的分子前体。第4章对全文进行了总结,同时也讨论了目前该领域仍然存在的问题和挑战,提出了一些解决问题的可行性方案。同时需要指出的是,本论文的该部分内容也对后续值得深入挖掘的研究工作进行了展望,期望该领域能够受到研究人员更为广泛的关注。

关键词： 二茂铁   膦配体   铜催化   钯催化   联烯   β-H消除   全碳季碳手性中心  

摘要： 近几十年来,不对称催化领域发展迅速,寻找新型、高效、实用的不对称催化转化,促进手性天然产物和药物的绿色合成一直是有机化学的研究热点。膦配体在过渡金属催化的不对称转化中发挥了重要作用,作为不对称金属催化的核心组成部分,是提高反应催化活性和立体选择性控制的关键。因此设计和合成结构新颖的膦配体对于发现新反应、提高现有反应的效率和实用性具有十分重要的作用。本论文,通过在二茂铁上同时引入二苯基膦和亚磺酰胺基团,设计合成了一类新型二茂铁亚磺酰胺膦配体—WJ-Phos,并将其作为手性配体应用于铜催化联烯的三组分不对称串联反应中;以及使用亚磺酰胺类膦配体实现了钯催化全取代烯醇三氟磺酸酯的不对称β-H消除反应,合成光学活性三取代联烯。具体研究工作有以下三个部分:一、新型二茂铁亚磺酰胺类膦配体的设计与合成研究二茂铁类配体具有独特的平面手性,作为催化剂或手性配体(例如:Josiphos和PPFA),已经被广泛应用于不对称催化反应中。我们以廉价易得的二茂铁甲醛为原料,经过醛基保护,在丁基锂的作用下引入二苯基膦,再脱除保护基得到邻二苯基膦二茂铁甲醛,之后与叔丁基亚磺酰胺反应高效的获得二茂铁类亚胺,最后和一系列格氏试剂或锂试剂加成,以优秀的非对映选择性制备出新型二茂铁亚磺酰胺类膦配体(WJ-Phos)。二、铜催化联烯的三组分不对称串联反应研究有机硼化合物是有机合成中重要的合成砌块,特别是在交叉偶联反应中。因此发展高效的新方法合成有机硼化合物,引起了有机化学家们广泛的关注。近年来,铜催化联烯三组分反应制备各种官能团化的有机硼化合物取得了很大的进展。在此背景下,我们基于WJ-Phos配体库合成的基础,成功地实现了铜催化联烯的三组分不对称串联反应,合成了一类含有全碳季碳手性中心的有机硼类化合物。底物拓展结果表明:WJ-Phos作为手性配体在铜催化联烯、联硼酸频那醇酯和酰氟的三组分不对称串联反应中,展现出了优秀的不对称诱导效果和底物兼容性,获得了一类β-硼-β,γ-不饱和酮化合物(高达88%产率和94%ee)。该合成方法特点是:收率较高、对映体选择性优秀、克级规模合成和多种合成转化。三、钯催化不对称β-H消除反应合成联烯的研究联烯在环加成、环化、环异构化、氧化、交叉偶联和硼酰化等方面的合成应用已经得到了广泛的研究。因此,发展简单高效的方法来合成联烯也就显得非常重要。由于烯基钯中间体的β-H消除在能量上是不利的,所以利用不对称β-H消除的方式合成轴手性联烯一直是一个长期的挑战。我们通过改造手性亚磺酰胺类单膦配体Xu-Phos实现了全取代烯醇三氟磺酸酯的不对称β-H消除反应,合成了轴手性三取代联烯。通过对Xu-Phos配体中N上保护基及碳手性取代基的微调,合成了一系列光学活性的三取代联烯。值得一提的是,钯催化三取代烯醇三氟磺酸酯的不对称β-H消除反应,合成轴手性二取代联烯酸酯已经被报道,但是全取代烯醇三氟磺酸酯的不对称β-H消除反应却未见报道。该反应还存在很多竞争性反应和副反应,我们通过配体库的优势成功地解决了这些难题。

关键词： ω-转氨酶   不对称合成   杂环胺   半理性设计  

摘要： 手性胺作为一种重要的医药中间体,在农业和化学工业中具有广泛的应用,目前,几乎一半的活性药物成分都至少含有一个手性胺单元,使手性胺成为制药工业中十分有价值的结构砌块。其中,杂环胺类化合物如光学纯的3-氨基哌啶和3-氨基吡咯,具有强大的生物活性,可用于抗细菌、抗病毒、抗肿瘤和抗结核等多种药物的合成。胺的工业化生产主要依赖于烯酰胺的金属催化氢化,但此方法成本昂贵,生产过程危险,污染严重,且生成的胺大多为非手性的。生物酶法合成手性胺以其经济、环保、反应条件温和、制备效率高等逐渐得到关注,其中,利用ω-转氨酶催化相应的前体酮不对称合成手性胺,以其优异的立体选择性成为手性胺工业化生产最具潜力的替代手段之一。本课题以手性杂环胺的高效制备为目的,通过基因挖掘技术开发新型的ω-转氨酶,并通过半理性设计对目标ω-转氨酶进行基于活性的分子改造,为实现手性杂环胺的酶法产业化生产奠定了良好的基础。主要研究内容如下:(1)ω-转氨酶的挖掘与筛选。本课题从Paenarthrobacter aurescens TC1、Alcaligenes faecalis ATCC8750及Aeropyrum pernix K1等9个菌株中共挖掘得到40个ω-转氨酶基因,并成功在大肠杆菌*** BL21(DE 3)中实现了异源表达。与实验室现有ω-转氨酶酶库合并后,构成了一个含有300个不同来源不同性质的ω-转氨酶酶库。以含氮杂环酮N-Boc-3-哌啶酮和N-Boc-3-吡咯烷酮为底物进行筛选,最终得到ω-转氨酶Cc-TA,在以异丙胺为氨基供体时,对10 mM N-Boc-3-哌啶酮和N-Boc-3-吡咯烷酮的转化率达到100%。该转氨酶虽然能够催化浓度高达1 M的N-Boc-3-哌啶酮和N-Boc-3-吡咯烷酮,但在反应过程中需要投入大量的催化剂,且反应时间较长。为了提高其工业化应用潜力,需要进一步提高Cc-TA的催化活力,以实现催化工艺的经济性。(2)基于半理性设计提高酶的催化活性。以N-Boc-3-哌啶酮为底物,通过序列比对和分子对接,综合考虑底物的疏水特性,选取突变热点Q25和R424,以营造疏水性空腔和底物通道。首先对Q25进行饱和突变,筛选得到第一轮的最佳突变体Q25F,对于N-Boc-3-哌啶酮的比活力是野生型的8.85倍。在第一轮突变的基础上,进行组合突变,将极性带电荷的R424突变为其他疏水性的氨基酸残基,最终得到了一个双点突变体Cc-TA-Q25F/R424L,对N-Boc-3-哌啶酮的比活力较野生型提高了 15.82倍,kcat/Km值较野生型提高了 35.27倍。利用生物信息学手段对Q25F和R424L位点影响酶催化活力的机制进行分析,从分子结构和相互作用力等方面解释了突变体催化活力提高的原因。(3)转氨酶合成手性杂环胺的工艺建立与优化。在保持催化底物浓度1 M时,探究了不同干菌体投量下对50 mL规模制备(S)-(+)-1-Boc-3-氨基哌啶和(S)-(-)-1-Boc-3-氨基吡咯烷的影响。对于底物N-Boc-3-哌啶酮,干菌体投量为30 g/L时,双点突变体Cc-TA-Q25F/R424L反应6h达到反应平衡,转化率达到了 96%(ee>99.9%);而野生型反应30h才达到反应平衡,转化率为93%;双点突变体Cc-TA-Q25F/R424L在干菌体投量为15 g/L时,反应12h达到反应平衡,转化率达到了 93%,反应时间较野生型在干菌体投量为30 g/L时缩短了18h。对于底物N-Boc-3-吡咯烷酮,在不同干菌体投量下,双点突变体Cc-TA-Q25F/R424L(ee>99.7%)和野生型均在24 h达到反应平衡,突变体转化率略有提高。本课题成功实现了利用ω-转氨酶酶法高效制备高浓度手性杂环胺的目标,为其工业化应用奠定了良好的基础。