关键词:
生物发光
模式识别
阵列传感器
时间分辨
线性判别分析
摘要:
近年来,光学传感器受到了分析领域的广泛关注,取得了迅速发展,在生化检测、临床诊断和环境监测等领域展现出巨大的应用潜力。其中,生物发光相比于荧光等其他光学方法具有低背景、高灵敏度和无需激发光源等优点。随着化学、生物和环境等科学领域的不断发展,对检测方法提出了越来越高的要求。传统的生物发光方法难以满足现代分析在高通量、复杂体系检测以及广泛适用性等方面的需求。为了更好地发挥生物发光技术的天然优势,本文开发了一系列基于发光细菌和萤火虫萤光素酶(FLuc)的生物发光传感器,成功应用于小分子化合物、环境污染物、生物大分子、病原菌和癌细胞实际样品等分析物的检测。具体内容如下:(1)为了提高生物发光分析方法的通量,我们设计了多种基于不同宿主的发光细菌,组成了活细胞生物发光阵列传感器,实现了手性氨基酸等小分子化合物的高通量检测。该阵列以活细胞代谢过程中对手性底物单一的选择性以及不同种类细菌细胞对生物小分子的响应不同为基础,通过生成特定的生物发光信号指纹图谱实现了39种手性氨基酸的快速准确的同时识别和定量检测。这种生物发光阵列对复杂混合体系具有良好的分析能力,可以根据游离氨基酸的成分准确分辨出乳制品的发酵时间。实现了生物发光方法在手性识别领域的首次应用。(2)得益于发光细菌是组成复杂的活细胞生物传感器,对不同种类的化合物具有广泛的响应能力,我们将此阵列应用于重要环境污染物重金属离子的快速识别和定量。与之前众多诱导型的发光细菌检测金属离子的方法相比,这种依靠细菌本身对金属离子不同毒性的响应来进行模式识别的策略极大缩短了响应时间和增加了分析的金属离子种类,并且可以显示出金属离子的生物毒性信息。这证实了发光细菌传感阵列应用的广泛性,可以预见其在食品工业、药物开发和环境监测等领域具有广阔的应用前景。(3)作为一种重要的生物毒性评价方法,传统的发光细菌法只能对亲水性毒物进行评价。疏水性污染物由于溶解性差,导致细菌难以接触到污染物,无法做到被准确评价。为了克服这一问题,赋予生物发光传感器在环境检测领域中更广泛的检测能力,我们通过将经表面修饰的发光细菌构建出Pickering乳液,成功实现了高疏水性多环芳烃(PAHs)生物毒性的评价,将微生物毒性评价法的适用范围扩大到了疏水性物质,且成功应用于土壤样品的分析。此方法为高疏水性毒物的生物毒性评价提供了解决方案,在环境污染监测领域具有重要的意义及实际应用前景。(4)为了实现生物大分子凝集素的高通量检测,我们提出了基于生物发光共振能量转移(BRET)原理的阵列传感方法。FLuc发光量子产率高,发光稳定,可被用作生物发光供体。我们合成出了三种以苝酰亚胺为母核和单糖衍生物为单体的多臂星形聚合物与FLuc组成BRET对,构建出BRET阵列。通过凝集素和FLuc两者与聚合物的竞争性结合,根据凝集素种类不同可以产生特定的BRET光学指纹信号。在线性判别分析方法的帮助下,完成了对多种凝集素的同时、快速识别和定量检测,与以往特异性检测方法相比大大提升了凝集素检测的通量。此外,我们还利用BRET阵列传感器根据病原菌表面的凝集素组成准确判断出了病原菌的种类。(5)在以上生物发光阵列研究的基础上,进一步开发了一种时间分辨的多通道生物发光阵列传感器,用于蛋白质的识别和癌细胞类型的识别。通过合成以苝酰亚胺为母核和偶氮苯衍生物为单体的多臂星形聚合物,与FLuc组成BRET对,构建出光敏BRET阵列。光敏传感单元于不同光照条件下发生随时间变化的构型转变改变了其与分析物之间的结合能力导致了输出的BRET信号变化,不同时间采集的BRET信号形成了每种蛋白质独特的光学指纹图谱。最终实现了以单一传感单元完成多种蛋白质的模式识别。阵列传感器的简化是提升传感器性能和实用性的一个重要的发展方向。此方法不仅可以识别多种蛋白质,而且成功对细胞裂解物进行了准确识别,在医学临床诊断中具有良好的应用前景。本文所开发的几种生物发光分析新方法在一定程度上解决分析领域的高通量、复杂体系检测和广泛适用性的难题,是新颖和有效的,对手性识别、环境监测和医学诊断等领域具有十分重要的意义。