关键词:
模式识别
试验设计
三七
质量评价
超临界流体色谱
摘要:
三七(Panax notoginseng(Burk.)***)是我国传统名贵中药材之一,中医中常用于散瘀止血、消肿定痛。长期以来,三七在中医药及保健品领域中占据着重要地位,全面了解其化学成分组成、确定关键活性成分、阐明成分之间相互作用机制对三七的质量控制与评价尤为重要。三七中化合物种类繁多、成分复杂、化合物结构差异大,这些问题为三七中化学成分分析及其质量评价带来了巨大挑战。目前三七分析及质量评价方法主要为液相色谱法(Liquid Chromatography,LC),如反相色谱、亲水色谱、离子交换色谱等。虽然LC对三七中大部分化学成分有较好的洗脱,但存在分析时间长、有机溶剂消耗量大、高极性物质洗脱效果差、平衡时间长等弊端。为了弥补LC的不足,实现中药三七系统全面分析,需求更加高效快速且能与LC互补的分析技术。超临界流体色谱(Supercritical Fluid Chromatography,SFC)是以超临界流体作为流动相,根据溶质在两相中分配系数不同从而实现物质分离的一种色谱技术,具有分析速度快、分离效率高、环境友好、与HPLC互补等优点,近年来,SFC已被广泛应用于中药分析、环境检测、食品分析等诸多领域。本论文以中药三七为对象,尝试将SFC技术结合模式识别用于中药三七的质量评价方法研究。首先考察了SFC结合蒸发光散射检测器(Evaporative Light-scattering Detector,ELSD)各项参数对检测器信号的影响,为三七中皂苷类成分SFC-ELSD方法开发提供了指南,通过结合指纹图谱相似度分析对不同三七样本质量进行了评价,证明了SFC-ELSD用于中药三七分析的可行性。其次,开发了一种高效快速的SFC-MS(Supercritical Fluid Chromatography-Mass Spectrometry,SFC-MS)方法结合化学模式识别技术用于中药三七的质量评价研究,SFC-MS结合偏最小二乘法判别分析(Partial Least Squares-Discriminant Analysis,PLS-DA)模型成功实现了不同采收期和不同部位三七样本的区分并得到潜在的可作为三七质量评价指标的特征成分。最后,通过体外药理活性试验对模型的准确性进行验证,选择三七经典止血活性结合统计学方法,深度挖掘了筛选得到的特征成分与经典止血活性之间相关性,对三七止血药效的物质基础进行了探讨。第一章:首先系统介绍了中药三七主要成分及目前常用质量评价方法,总结了现有方法存在的不足,其次全面介绍了SFC在中药质量评价方面的应用进展,在此基础之上提出了本论文的研究思路及创新点。第二章:通过响应面设计系统考察了SFC-ELSD方法开发中各项参数对检测器信号影响。首先通过Plackett-Burman试验对各个因素进行显著性评价,再利用Box-Behnken设计结合响应面法考察了各参数间相互作用并优化得到最佳方法,将该方法结合指纹图谱用于中药三七质量评价研究,为三七中皂苷类成分SFC-ELSD分析方法的开发提供了优化指南。第三章:成功建立了一种SFC-MS结合化学模式识别方法用于中药三七的质量评价研究。首先通过对固定相、改性剂、添加剂进行筛选得到适用于皂苷分析的色谱条件,再通过试验设计(Design of Experiments,Do E)进一步优化得到最佳分析方法,通过各项方法学指标验证了该方法可行性。通过结合层次聚类分析(Hierarchical Clustering Analysis,HCA)、主成分分析法(Principal Components Analysis,PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)等多种模式识别方法,分别根据化合物的峰面积和含量建立模式识别模型对不同药用部位和不同采收期的三七质量进行评价。结果表明基于化合物峰面积的PLS-DA分类模型可准确区分不同采收期和不同部位三七样本,特征成分人参皂苷Rg、人参皂苷Rg、人参皂苷Rb可作为三七潜在的质量标志物,SFC-MS技术结合PLS-DA方法在三七质量评价领域具有一定的应用前景。第四章:从活性的角度验证了分类模型及特征性成分的科学性。以三七止血活性为指标,采用体外活性评价的方法测定了三七不同部位和不同采收期提取物对空白人血浆凝血酶时间(Thrombin Time,TT)、凝血酶原时间(Prothrombin Time,PT)和活化部分凝血酶时间(Activeated Partial Thromboplasting Time,APTT)的影响,并对化合物含量与凝血活性之间相关性进行了考察。结果表明不同采收期的样本在凝血酶时间上存在显著性差异,筛选得到的三个特征成分与凝血酶时间均存在显著相关性,进一步证明了筛选出的三个特征成分可作为三七质