关键词:
日本沼虾
先天免疫
模式识别受体
SVWC
Ficolin
摘要:
模式识别受体(Pattern recognition receptor,PRR)被认为是无脊椎动物先天免疫的重要组分,可以准确识别入侵微生物的病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular pattern,PAMP),触发细胞和体液免疫反应以清除病原。近三十年来,由于经济价值的重要性,有关甲壳动物抗病机制的研究得到了长足进展,多种PRR家族成员得到同源克隆,但缺乏对其功能的深入分析和比较研究。本研究以重要淡水经济甲壳动物日本沼虾(Macrobrachium nipponense)为材料,通过生物信息学手段从转录组中全面搜索PRR基因并对其编码蛋白的分子特征进行系统分析,并对部分成员的功能进行了鉴定。此外,本研究还通过功能分析鉴定了一种新的PRR家族—Single von Willebrand factor C-domain protein(SVWC),并重点对该家族成员的微生物识别机制和免疫调控功能进行了深入分析。主要研究结果如下:1.利用生物信息手段,从日本沼虾TSA数据库中筛选到10个PRR家族,共264个成员,分别为Mn BGRP(8条)、Mn CTL(147条)、Mn Galectin(1条)、Mn FREP(40条)、MnSR(7条)、Mn TEP(17条)、Mn TLR(7条)、MnSPH(21条)、Mn TRBP(12条)和Mn DM9-CP(4条)。2.利用生物信息手段,从日本沼虾转录组中筛选并鉴定了4条MnSVWCs。通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR),分析了4条MnSVWCs的组织分布情况以及维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)刺激后的时间表达谱。MnSVWC1-4分别在鳃、血细胞、肌肉、鳃中表达量最高。***刺激后,在鳃中,MnSVWC1和MnSVWC2转录增加,MnSVWC3表达量下调,MnSVWC4无响应;在血细胞中,MnSVWC1和MnSVWC4表达量下调,MnSVWC2和MnSVWC3转录增加;在神经中,MnSVWC1-4表达量均上调。通过原核表达系统和蛋白纯化、复性等技术,成功得到有活性的rMnSVWCs,体外实验发现rMnSVWCs具有广谱的微生物结合活性(rMnSVWC2-4为Ca2+依赖型微生物结合活性)和Ca2+依赖型微生物凝集活性,这些微生物包括革兰氏阴性菌(大肠杆菌和维氏气单胞菌),革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌)和毕赤酵母。通过ELISA分析发现rMnSVWCs以及rMnSVWC1-mut P57A均可以与LPS、Lys-type PGN、Dap-type PGN、Gal、MAN和BG这6种PAMPs结合,但是rMnSVWC1-mut P57A与PAMPs的亲和力低于rMnSVWC1。通过RNAi、单抗制备以及免疫荧光技术对rMnSVWC1的抗菌机制进行研究,经研究发现MnSVWC1基因的敲低降低了机体对入侵细菌的清除能力,但未阻断Toll通路和节肢动物免疫缺陷(IMD)通路的活性,不介导抗菌肽基因的表达,也不会激活pro PO系统。而是通过与血细胞表面结合促进血细胞对入侵细菌的吞噬,从而增强对细菌的清除能力,或者直接发挥抑菌功能。这些结果表明,MnSVWC1可以作为潜在的模式识别受体(PPR),通过识别PAMPs,凝集侵入性微生物并促进血细胞的吞噬作用来介导细胞免疫应答,或者发挥抗菌肽功能,直接抑制细菌生长。3.本研究通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR),分析了4条MnSVWCs在白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)刺激后的时间表达谱,结果表明MnSVWC1-4在鳃、血细胞和神经中,表达量均上调。对MnSVWC1抗病毒机制研究发现,MnSVWC1可以抑制WSSV在体内的增殖。在体外,Western Blot和ELISA实验显示rMnSVWC1可以与WSSV结合。经过IP检测,我们找到了WSSV上MnSVWC的靶蛋白——VP26和VP28。此外,MnSVWC1可以通过激活JAK-STAT通路分泌Mn Viperin以及促进血细胞对入侵WSSV的吞噬发挥抗病毒功能。4.从日本沼虾转录组中鉴定了一条新的纤维蛋白原相关蛋白基因,命名为Mnfico3。Mnfico3的完整c DNA序列长1133 bp,包含一个765 bp的开放阅读框,编码254个氨基酸残基。Mnfico3蛋白包含一个假定的N端信号肽和一个C端纤维蛋白原相关蛋白结构域。系统发育分析表明,Mnfico3与脊椎动物纤维蛋白的进化关系比其无脊椎动物同源物更近。组织分布分析表明,Mnfico3主要在肌肉中表达,在其受到细菌刺激后,其转录增加。使用重组蛋白的功能分析表明,rMnfico3具有与多种微生物和病原