关键词:
牙周炎
微流控芯片
炎症因子
成骨细胞
摘要:
目的:牙周炎是一种常见的慢性口腔疾病,也是危害最为广泛的慢性炎性骨破坏性疾病。在炎性情况下,牙槽骨遭到破坏的主要原因是成骨细胞功能性受损。通常对于成骨细胞的培养条件为使用细胞培养瓶、培养皿等进行的成骨细胞二维培养,其不足以客观、真实、准确的体现成骨细胞所生活的复杂的体内微环境。微流控芯片是目前已被公认的用于系统生物学研究的主要技术平台之一,它的通道尺寸与细胞的尺寸十分匹配,能够对细胞所处的流体环境进行精确地控制,同时能够节省大量的试剂和细胞,与传统细胞培养技术相比,具有无法比拟的优势。本课题在微流控芯片平台的基础上,建立微流体条件下的炎症细胞因子对成骨细胞生物学活性的影响的体系,力求更为真实客观的模拟体内炎性微环境,评价炎症环境下成骨细胞的生物学行为,为后续牙周炎器官芯片的构建提供细胞体系的基础,为牙周抗炎药物筛选平台的建立提供实验学基础。方法1.芯片的设计和制备选取芯片模具制备微流控芯片模板,选用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制备芯片。芯片模型分四层,通过预聚物热固化、等离子处理的方法分别将芯片第一层、第二层,第三层第四层封接,并在中间夹层放置聚酯碳酸酯膜(小鼠的成骨细胞MC3T3-E1于聚酯碳酸酯膜上培养),实现芯片的制作。2.炎症因子的筛选为了能够明确不同炎症细胞因子在不同浓度下对成骨细胞活性的影响,我们选择细胞活性良好的小鼠成骨细胞系MC3T3-E1,分为两组,培养液中含有0ng/ml,0.1ng/ml,1ng/ml,10ng/ml,100ng/ml的TNF-α组及IL-1β组,采用LIVE/DEAD细胞活性/细胞毒性试剂盒测定细胞活力,筛选出用于构建牙周芯片的炎症细胞因子及其浓度。3.芯片微环境的测试选择芯片通道微米柱宽度相同,高度为100um,140um,180um,220um,260um的芯片培养池进行细胞培养,观察不同的芯片通道微米柱尺寸是否对细胞生长产生影响,完成芯片通道高度的分选;通过观察不同包被条件下细胞的形态,完成细胞包被条件的确认。4.微流体环境下TNF-a对成骨细胞活性、凋亡的影响将小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞大部分附着在包被好聚碳酸酯膜上,将其置于芯片二、三层夹层中,有细胞一面朝下;在芯片a、c孔中用软管连接注射泵,b、d用软管连接2ml离心管使液体流出,选择芯片的高度为220um;在上层芯片培养池中注入无血清高糖培养液,下层芯片培养池中注入浓度为1ng/ml TNF-a含有血清培养液。通过对微流控芯片注射泵的调控,精细控制炎症细胞因子对成骨细胞生物学活性影响,通过Dead/Live试剂盒染色检测TNF-a刺激成骨细胞增值凋亡情况。结果:1.当炎症细胞因子TNF-a浓度为1ng/ml时,成骨细胞开始明显死亡,随着TNF-a浓度的增加,成骨细胞死亡数目增多。当IL-1β浓度为1ng/ml时,成骨细胞开始明显死亡,并且随着IL-1β浓度的增加,成骨细胞死亡数目增多,呈正性关系。并且TNF-a比IL-1β更能使成骨细胞活性降低。2.随着芯片微米柱高度的不断增高,细胞生长分化程度越好,尤其在220um和260um时,细胞生长分化程度最好;胶原包被下的细胞分化程度最好。3.在未加入TNF-α的情况下,微流体芯片培养组与孔板培养组荧光显微镜下均为绿色视野,即两组细胞均活性良好;随着TNF-α的增加,大量绿染的活细胞中出现红染的死细胞,且微流体芯片培养组红细胞更为密集;TNF-α浓度增大至100ng/ml时,微流体芯片培养组为死细胞遍布的红色视野,仅见数个绿染的活细胞,孔板培养组余留的绿染的活细胞数量相对较多。荧光强度的采集及分析显示,在相同浓度的TNF-α的作用下,微流体芯片培养组的成骨细胞死亡数目明显多于孔板中培养的成骨细胞死亡数目(P<0.05),随着TNF-α浓度的增高,成骨细胞的细胞活性的降低在微流体芯片培养组更为明显(P<0.01)。结论:本实验设计并构建了集成化的微流控芯片系统,成功建立了微流体环境下的炎症因子对成骨细胞生物学活性影响的平台,证实在相同浓度的TNF-α的作用下,微流体芯片培养组的成骨细胞死亡数目明显多于孔板中培养的成骨细胞死亡数目,且随着TNF-α浓度的增高,成骨细胞的细胞活性的降低在微流体芯片培养组更为明显。为后续牙周炎器官芯片的构建及牙周抗炎药物筛选平台的建立提供了实验学基础。