关键词:
大口黑鲈
蛙虹彩病毒
同步接种病毒
异步接种病毒
摘要:
为优化大口黑鲈蛙虹彩病毒(LMBV)在细胞中的最佳增殖条件,本研究通过测定鳜脑组织细胞系(CPB)和鲤鱼上皮瘤(EPC)细胞系的生长曲线后,分别以不同MOI(1、0.1、0.01)LMBV感染不同初始细胞数量的CPB细胞(2.5×10^(5) 个/mL、4×10^(5) 个/mL、5×10^(5) 个/mL,根据细胞生长曲线确定为对数生长期及接近该期的细胞数量,后同)和EPC细胞(1×10^(6)个/mL、2×10^(6)个/mL、3×10^(6)个/mL),28℃培养至细胞完全病变,采用荧光定量PCR(qPCR)和Muench-Reed法分别测定病毒拷贝数和病毒滴度(TCID_(50))。结果显示,以MOI 0.1的LMBV感染4×10^(5) 个/mL CPB细胞时病毒产量最高,此时病毒拷贝数为107.4拷贝/μL,病毒滴度为108.75TCID_(50)/mL;以MOI 0.1的LMBV感染1×10^(6)个/mL EPC细胞时病毒产量最高,此时病毒拷贝数为10^(5.8)拷贝/μL,病毒滴度为105.54TCID_(50)/mL。表明CPB细胞更适合LMBV的增殖。为进一步筛选LMBV在CPB细胞中的最佳增殖条件,分别采用异步法接种病毒(初始CPB细胞数量分别为2.5×10^(5) 个/mL、4×10^(5) 个/mL及5×10^(5) 个/mL,LMBV的MOI分别为1、0.1及0.01)和同步接种病毒(初始CPB细胞数量分别为2.5×10^(5) 个/mL、4×10^(5) 个/mL及5×10^(5) 个/mL,FBS含量分别为4%、6%、8%及10%,LMBV的MOI分别为1、0.1及0.01),28℃培养至各组细胞完全病变后,分别采用上述qPCR和Muench-Reed法测定各组细胞中的病毒拷贝数和病毒滴度,比较两种接种方式LMBV的最佳增殖条件。结果显示,采用异步接种病毒时,当初始CPB细胞的数量为4×10^(5) 个/mL、MOI为0.1时LMBV拷贝数和病毒滴度均最高,分别为10^(7.18)拷贝/μL和10^(8.22)TCID_(50)/mL;采用同步接种病毒时,当初始CPB细胞的数量为4×10^(5) 个/mL、FBS含量为8%、MOI为0.1时获得的LMBV拷贝数和滴度均最高,分别为107.54拷贝/μL和10^(8.67)TCID_(50)/mL。上述结果表明,当初始CPB细胞数量为4×10^(5) 个/mL、FBS含量为8%、LMBV的MOI为0.1,并且采用同步接种病毒的方式是LMBV在CPB细胞中的最佳增殖条件。综上,本研究首次筛选到LMBV的易感细胞系,确定了LMBV在CPB细胞中的最佳增殖条件,为LMBV的大量生产及疫苗的研发提供了数据参考及技术指导。