关键词：
海洋生物毒素
适配体
配体指数富集系统进化技术
检测方法
信号扩增
摘要：
近年来,随着海洋赤潮和湖泊蓝藻爆发的加剧,人们因食用含海洋毒素的水产品引发的中毒事件逐渐增多,这对人类健康和水产品行业造成了严重危害。因此,快速准确地检测水产品中的海洋毒素显得尤为重要。海洋毒素多为小分子物质,免疫原性弱,传统免疫检测的抗体制备难度较大。适配体是通过体外筛选获得的一种单链寡核苷酸。作为一类新型识别分子,适配体不仅具有和抗体相似的亲和力和特异性,而且靶标范围广、稳定性好、便于修饰,其体外筛选和合成的方式也更方便。近年来,针对各种食品危害因子的适配体筛选和检测应用层出不穷,在海洋毒素的分析检测方面也刚崭露头角。本论文以藻类或微生物产生的四种海产品中广泛存在的海洋毒素为研究对象,运用改进的非固定靶标SELEX技术筛选其ssDNA适配体,并结合纳米金显色技术、荧光检测技术、滚环扩增技术、基于核酸酶的信号扩增技术、磁分离技术等,建立了一系列简单、灵敏、准确、高效的海洋毒素检测新方法,为丰富和提高海洋毒素的检测和监控技术提供了新思路和新方法。首先,利用非固定化GO-SELEX技术筛选大田软海绵酸（OA）适配体。在靶标与ssDNA文库孵育后,加入氧化石墨烯（GO）吸附未结合的ssDNA,而靶标/ssDNA复合物保持游离状态,通过离心实现两者的分离,建立了三种模式交替筛选的GO-SELEX。经过13轮筛选和随后的克隆测序、序列分析、亲和力特异性检测,选出一条最佳的适配体序列OA-27,其Kd值达42±4 nM。进一步对比模拟的二级结构,发现其完整序列和随机区序列具有相似的茎环结构,对随机区序列进行亲和力特异性分析后,得到了截短的适配体序列OA27-1,其Kd值为40±13 nM。其次,改进GO-SELEX,建立多重MRGO-SELEX技术,同时筛选石房蛤毒素（STX）、软骨藻酸（DA）、河豚毒素（TTX）三种海洋毒素的适配体。采用一锅法合成磁性还原氧化石墨烯（MRGO）并对其进行表征,利用MRGO的磁分离和吸附单链寡核苷酸的特性,可在SELEX中有效分离与靶标结合的单链DNA和未结合的游离单链DNA,并简化分离操作。经过最初十二轮的三种靶标混合筛选和随后四轮的单一靶标筛选,获得了多条适配体候选序列,并采用荧光法对其进行亲和力特异性分析。最终,获得了分别对DA、TTX和STX具有高亲和力特异性的适配体DA-06（Kd=62.07±19.97 nM）、TTX-07（Kd=44.12±15.38 nM）和STX-41（Kd=61.44±23.18 nM）。通过一种简单的荧光共振能量转移（FRET）检测法验证了这些适配体用于检测的可行性。此外,也得到了对DA和TTX都有亲和力的两条适配体DA-01和TTX-27。第三,利用基于纳米金显色的竞争型酶联适配体分析法（ELAA）检测大田软海绵酸。将GO-SELEX筛选得到的适配体OA27-1固定在微孔板上,采用过氧化氢酶标记的适配体互补链与OA竞争结合固定的OA适配体,利用过氧化氢酶催化H2O2分解,不同浓度H2O2还原氯金酸产生不同聚集状态的纳米金,显示出不同的颜色,从而实现OA的比色检测。在最优条件下,该方法具有检测限低（LOD=0.01 ng/mL）、线性检测范围宽（0.025-10ng/m L）、加标回收率好（92.86-103.34%）、重复性好（RSD为2.28-4.53%）的特点,可以用于高灵敏检测海产品中的OA。第四,利用滚环复制（RCA）扩增信号和荧光检测技术建立更灵敏的竞争型适配体分析法检测大田软海绵酸。先将OA适配体作为捕获探针固定在微孔板上,通过杂交结合由RCA产物和FAM标记信号探针组成的荧光检测探针组装微孔板。通过OA与荧光检测探针竞争结合固定的OA适配体,达到荧光检测OA的目的。依靠RCA的信号放大作用,在1 pg/mL-100 ng/m L范围内,荧光强度和OA浓度的对数值呈良好的线性关系,检测限达1 pg/m L。该方法检测蛤蜊样品中的OA,加标回收率达97.12-108.93%,并且与ELISA商品试剂盒的检测结果具有很好的一致性。第五,利用基于核酸酶的靶标循环利用扩增信号技术开发高灵敏的石房蛤毒素荧光共振能量转移适配体传感器。将MRGO-SELEX筛选到的适配体STX-41与石墨烯量子点（GQDs）连接,通过MRGO的吸附,建立荧光淬灭体系。STX与适配体结合可使其从MRGO表面解吸附,荧光恢复,实现STX的荧光检测。DNase I可酶解与STX结合的适配体,释放STX,使其循环利用,与更多的适配体结合,达到信号扩增的目的。在最优条件下,该荧光适配体分析法可以检测0.1-100 ng/m L的STX,检测限达0.1 ng/m L,证明该方法可用于高灵敏检测石房蛤毒素。总之,本论文改进了适用于小分子靶标适配体筛选的非固定化GO-SELEX方法,筛选得到了对
