关键词：
海洋生物活性成分
液质连用
相互作用
结合率
抗肿瘤活性
摘要：
从海洋生物中寻找和筛选具有药用价值的活性先导化合物是药物研发的一个重要趋势。而海洋药物研发的第一步就是活性成分的筛选。传统的药物筛选都是以抗菌实验、体外细胞模型实验及动物模型实验考察药物的生理作用,具有步骤繁琐,要求高,时间长等缺点。本文根据海洋生物活性成分与肿瘤细胞相互作用的可能机理,建立了海洋药物活性成分筛选的新方法。首先,以已知生物活性的中药为模式天然药物,建立分析方法及活性测试方法,为后续实验研究奠定基础。采用HPLC分别对红花超纯水提取物中的羟基红花黄色素A以及延胡索超纯水提取物中的延胡索乙素进行了定性定量分析。在此基础上,选用常见的人类HepG2肝癌细胞作为实验对象,采用CCK-8法探讨了羟基红花黄色素A(HSYA)及延胡索乙素体外对细胞活力的影响。HSYA和延胡索乙素作用于HepG2实验结果与文献报道的结果基本相符,证明该方法可用于天然生物活性成分的分离及活性测试。其次,使用HPLC-RID以及HPLC-MS联用仪器,分别对13种海洋天然生物的水提物中的物质进行探究。选取超纯水和乙腈作为流动相,采用RID检测器与等度洗脱程序,对海洋生物提取物进行分离,结果5种样品检测出峰,其中GG07和KG04分离效果良好。选取超纯水和甲醇作为流动相,采用质谱法对海洋生物提取物中的进行初步测定。结合HPLC与质谱检测结果,推测海洋生物提取物中应该含有海洋多糖类物质。在此基础上,采用HPLC-MS法分析了壳聚糖样品KG04、海绵提取物样品HJ12中某一分子量成分与大肠杆菌及金黄色葡萄球菌相互作用的特性。结果发现,壳寡糖KG04中分子量为531的物质和海绵提取物样品HJ12中分子量为403的物质与大肠杆菌细胞以及金黄色葡萄球菌相互作用的结合率均不高,随浓度升高并无太大变化。采用HPLC-MS法分析了海绵提取物样品HJ12中分子量为401和431与人类肝癌细胞HepG2相互作用的特性。结果发现,海绵提取物样品HJ12中分子量为403和海绵水提物中431的样品与HepG2肝癌细胞相互作用前后的结合率随样品浓度的增大而增大。因此,海绵提取物样品HJ12和海绵水提物可能会有促肿瘤凋亡或致死作用。再次,为验证海洋生物活性物质与微生物间及与肿瘤细胞相互作用与抗菌活性、抗肿瘤之间关系,进行了抗菌活性测试和抗肿瘤活性测试。根据抑菌试验结果,在实验浓度下,12种海洋生物提取物与大肠杆菌及金黄色葡萄球菌作用24h后,培养皿上均没有抑菌圈出现。选用CCK-8法及Annexin V-FTIC/PI流式细胞仪检测法探究了海绵提取物样品HJ12中分子量为403和海绵水提物中431的样品对HepG2肿瘤细胞活性影响,发现随海绵水提物浓度的增加,HepG2肝癌细胞的凋亡率逐渐升高。早期凋亡及晚期凋亡的细胞数量都表现出良好的一致性,说明这两种活性物质可以诱导肿瘤细胞进入凋亡模式。与第三章中的结合率实验相比,活性物质与肿瘤细胞间的结合率越高,表现出的促凋亡作用越明显。在此基础上,考察了其他多种来源于不同海洋生物的提取物的抗肿瘤细胞活性。总结如下:红藻寡糖样品QJ03、异麦芽寡糖样品YM06、珊瑚提取物样品SS10和珊瑚提取物样品SM11在实验浓度作用下,正常细胞群与凋亡细胞群数量并未发生明显改变,无增殖现象,细胞凋亡率维持在稳定的低水平,说明QJ03、YM06、SS10和SM11对细胞无明显作用。红藻寡糖样品KL02在实验浓度作用下,细胞凋亡率明显有所增加,但是细胞的凋亡率先减少后增加,原因有待进一步研究。褐藻寡糖样品HZ01、壳寡糖样品KG04、木寡糖样品MG05、果寡糖样品GG07、海马提取物样品SB08、海马提取物样品CC09、海绵提取物样品HJ12和海绵水提物在实验浓度作用下,细胞的凋亡率有所提高。而且,随浓度的提高,HZ01、MG05、GG07、CC09几种样品的促凋亡率并没有进一步提高;而SB08的促凋亡率在低浓度时没有太大变化,高浓度时表现良好的促凋亡作用。与此不同的是,KG04样品随浓度的升高,其促凋亡率随之升高,表现在良好的应用前景。本研究工作的创新之处在于使用HPLC-MS联用,建立海洋生物活性成分与细菌、肿瘤细胞体外相互作用的指纹分析方法,并发现活性成分与细菌及肿瘤细胞间的结合率与海洋生物活性成分的抗菌活性、抗肿瘤细胞活性表现出一致性。计算活性成分与不同细胞间相互作用后的结合率,可用于表征海洋生物活性成分的抗肿瘤活性,为海洋药物的筛选提供了一种快速的、简单的方法。
