关键词：
Oxalicumone A(POA)
细胞毒性
凋亡
线粒体通路
氧化应激
摘要：
目的：恶性肿瘤是一种严重危害人民生命健康的常见病,是仅次于心脑血管病的第二位死因,经调查其发病率近年来逐年增加。然而目前癌症治疗效果还不是很理想,攻克癌症的艰巨性以及癌症危害的严重性到今日已引起许多国家政府、公众和科学界的巨大重视。所以,攻克肿瘤的主要途径仍然是寻找和开发高效低毒的抗肿瘤药物。抗肿瘤海洋候选新药POA是从海洋共附生真菌Penicillium sp.中分离得到的一种结构新颖的二氢噻吩并色酮类化合物。大量的前期研究证明POA对抑制恶性黑色素瘤细胞株A375、肺癌细胞株A549、宫颈癌细胞株HeLa、乳腺癌细胞株MCF-7、喉癌细胞株Hep-2、肝癌细胞株HepG2、肠癌细胞株SW-620有显著性作用(IC50 ≤101μM)。本实验以其为研究对象,在人正常肝细胞L-02、人肾近曲小管上皮细胞HK-2上进行POA体外染毒实验,对其作为抗肿瘤候选新药的早期安全性进行评价。采用CCK8法、Hoechst染色形态学观察,检测不同浓度POA对人正常肝细胞L-02、人肾近曲小管上皮细胞HK-2的毒性。探究POA产生细胞毒性的机制,通过Caspase-3活性检测,并通过PI、AnnexinV/PI染色给药后的L-02、HK-2细胞,运用流式细胞仪,检测细胞周期和细胞早期凋亡率。进一步利用紫外分光光度法测定POA作用后肝肾细胞样本,通过考察AST、ALT、LDH、NAG、SOD、MDA、GSH、NO、NOS值变化,同时检测活性氧(ROS)、线粒体膜电位(MMP)、ATP、线粒体膜通透孔(MPTP)的值,探讨POA产生细胞毒性的机制。再进一步通过Western-bloting实验,检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Fas、Cyt-C的表达,进一步阐明POA导致肝肾毒性的作用机制。通过上述检测方法和指标来综合评价POA的体外肝肾毒性以及导致肝肾细胞毒性的浓度范围和引发肝肾毒性的机制,评价其作为抗肿瘤候选新药的安全性。方法：***8法检测POA对细胞的抑制率利用CCK8中[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯),2H,四唑单钠盐]在电子载体1,甲氧基-5,甲基吩嗪鲦硫酸二甲酯的作用下被活细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物的这一特性对POA对肝肾细胞的毒性进行分析。2. Hoechst33258染色观察细胞形态学变化不同浓度的POA处理肝肾细胞,Hoechst 33258进行染色,于荧光显微镜下观察细胞形态的改变,评估药物对细胞引起的凋亡情况。3. PI、AnnexinV/PI染色检测细胞周期及早期凋亡情况采用流式细胞仪技术记录细胞的周期分布及凋亡比例情况,以Sub-G1期及AnnexinV+/PI-象细胞所占比例作为细胞凋亡判别指标,研究不同剂量POA对肝肾细胞凋亡的影响。4.肝肾细胞中Caspase家族活性的影响采用Caspase-3活性检测试剂盒检测不同浓度给药组肝。肾细胞的Caspase-3活性,研究POA对Caspase家族活性的影响。5. AST, ALT, LDH、NAG、SOD、MDA、GSH、NO、NOS指标检测在药物作用的24 h后,取培养液的上清液或细胞裂解液,按各试剂盒中所述方法对SOD, MDA, LDH, GSH, NOS, NO, AST, ALT进行测定,检测POA对肝肾细胞氧化应激平衡的影响。6.肝肾细胞中活性氧(ROS)的的影响感官活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括氧自由基、过氧化氢及其下游产物过氧化物和羟化物等,参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。采用活性氧捕获剂DCFH-DA,运用流式细胞仪技术检测细胞活性氧值的变化。7. Western-bloting技术检测凋亡相关蛋白的表达运用蛋白质印迹法,通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞样品进行着色的基本原理分析Bax、Bcl-2、Fas蛋白质在所分析的细胞中的表达情况,来反应POA对肝肾细胞中与线粒体通路相关蛋白的影响。8.线粒体膜电位(MMP)、ATP、线粒体膜通透孔(MPTP)的值、Cyt-C蛋白的表达运用荧光染料JC,1,收集细胞样品按试剂盒所述方法检测细胞的荧光强度,计算POA对肝肾细胞MMP的影响；运用ATP、MPTP检测试剂盒,按各试剂盒中所述方法进行检测,同时运用Western-bloting技术检测线粒体相关蛋白Cyt-C的表达,综上总结POA对肝肾细胞线粒体通路的影响。结果：***对细胞的抑制率结果POA对L-02、HK-2细胞均具有显著抑制作用,且其抑制效应呈现一定的时间,剂量相关性。在L-02细胞中,24 h时间段,POA体外抑制作用随着给药浓度的增加呈现显著性的递增趋势。0～60μmol·L-1范围内,48
