关键词:
软珊瑚
Sinularia flexibilis
抗炎活性
海绵
Stellettin B
抗类风湿性关节炎
作用机制
摘要:
海洋约占地球总表面积71%,是地球上最大的生命栖息地。由于海洋生态环境的特殊性(高盐度、高压、缺氧、避光)和生物链之间的密切相关性,海洋生物次生代谢产物与陆地植物提取的化合物具有显著结构差异,其中有些产物结构新颖独特并具有良好的生物活性,是药物研究与开发的基础和宝库。海洋生物软珊瑚(Soft coral)和海绵(Marine sponge)一直是海洋天然产物的研究热点。为进一步发现海洋产物结构多样性及新颖性,寻找活性强、作用机制新颖的先导化合物。本实验选取了两种海洋生物作为研究对象,进行了研究与探索:(1)对采自中国南海三亚附近海域的软珊瑚Sinularia flexibilis进行了化学成分研究和抗炎活性初筛;(2)对从南海海绵Jaspis stellifera中分离得到的具有抗类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)活性的先导化合物Stellettin B进行了抗类风湿性关节炎作用机制的探索。本文以甲醇为提取溶剂,对软珊瑚样品Sinularia flexibilis进行多次提取,对甲醇提取浓缩物用水和二氯甲烷进行萃取,得到水层和二氯甲烷层提取物,综合运用硅胶薄层色谱、柱色谱、半制备HPLC等多种分离手段,从软珊瑚Sinularia flexibilis二氯甲烷层提取浓缩物中共分离得到12个化合物,结合核磁共振光谱(1D、2D NMR)、质谱(ESI-MS)、红外光谱(IR)和相关文献鉴定出化合物的平面结构及立体结构,分别为:sinulaflexiolide L(1),isosinuflexibilin D(2),thioflexibilolide A(3),(-)14-deoxycrassin(4),(1R,13S,12S,9S,8R,5S,4R)-9-acetoxy-5,8:12,13-diepoxycembr-15(17)-en-16,4-olide(5),sinulariolide(6),dihydrosinularin(7),sinularin(8),11-dehydrosinulariolide(9),epoxycembrane A(10),diepoxyceane A(11),flexilarin B(12);其中化合物1和2为未见文献报道的新化合物。本文利用RAW264.7巨噬细胞进行了各单体化合物对一氧化氮(Nitric Oxide,NO)抑制作用的初步研究。在非细胞毒剂量下,以Griess法检测各化合物对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW264.7细胞释放NO抑制活性。结果表明,化合物5、6、7和9具有明确的NO生成抑制作用,IC50值分别为24.0μM、42.2μM、6.1μM和8.5μM。本文采用类风湿关节炎患者的呈纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocyte,FLS)为Stellettin B抗RA作用机制模型,利用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,MTT)法评价化合物细胞毒性,以AnnexinV/PI双染色法检测其对FLS细胞凋亡的影响,采用流式细胞仪检测其对FLS细胞周期的影响,采用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assy,ELISA)检测在LPS诱导下,化合物对体外培养的FLS细胞上清液中的白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、IL-17、基质金属蛋白酶-3(Matrix Metalloproteinase-3,MMP-3)和基质金属蛋白酶抑制剂-1(Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1,TIMP-1)分泌水平的影响,探索化合物抗RA作用机制,结果如下:***法检测细胞毒性:Stellettin B对FLS细胞显示了很强的毒性作用,IC50值为5.86μM。2.流式细胞仪检测凋亡及周期:药物浓度在1、5和10μM时,细胞的凋亡率与药物浓度呈剂量依赖性;但当药物浓度达到50μM时,细胞的凋亡率不高,但坏死率大大增加。当药物浓度为1和5μM时,其对G2/M期有显著地阻滞作用。***法检测:在LPS诱导下,Stellettin B显著地抑制IL-1β、TNF-α分泌,且抑制率呈剂量依赖性;对IL-17分泌有较弱的抑制作用;对MMP-3分泌有抑制作用,对TIMP-1分泌有促进作用,MMP-3/TIMP-1比值随着浓度的降低呈增高趋势。上述抗NO产生的活性评价表明,软珊瑚Sinularia flexibilis中含有抗炎有效成分,其