关键词：
海洋生物
小分子物质
乙肝病毒
筛选
摘要：
目的:乙型病毒性肝炎是我国的常见病,严重威胁居民的生命和健康。遗憾的是,目前对乙肝的治疗依然缺乏非常有效的药物。海洋是地球的重要组成部分,生活在海洋的生物可能具有多种抗病功效,本研究尝试对从海洋生物提取的20种天然小分子物质进行体外抗乙肝病毒效果评价,希望能筛选到一些可能具有抗乙肝病毒作用的物质。方法:1、本研究拟评价的20种海洋小分子物质来由广西北部湾海洋研究所提供,这20种化合物分别是:8-甲基-环(S-脯氨酸-R-亮氨酸),分子式:C20H30O4简称B2;邻苯二甲酸二(2-丙基)戊酯,分子式:C24H3804简称B3;环(脯氨酸-亮氨酸)分子式:C11H18N202简称B4;2-(4-氨基苯)乙醇,分子式:C8H11NO简称B7;8-甲基-环(S-脯氨酸-R-亮氨酸),分子式:C12H20N2O2简称B7;胆甾醇,分子式:C27 H460简称S1;胸腺嘧啶,分子式:C5H6N202简称S3;腺嘌呤,分子式:C6H6N402简称S5;尼克酰胺,分子式:C6 H6 N2 O简称S7;对羟基苯甲酸,分子式:C7H603简称S8;2-羟基脯氨酸-亮氨酸,分子式:C11H18N203简称H1;4-羟基脯氨酸-α-氨基苯乙酸),分子式:C13H14N203简称H2;甘氨酸-2-氨基丁酸,分子式:C6H10N202简称H3;甘氨酸-亮氨酸,分子式:C8H14N202简称H4;甘氨酸-L-脯氨酸,分子式:C7H10N203简称H5;D-脯氨酸-L-缬氨酸,分子式:C10H16N202简称H6;脯氨酸-亮氨酸,分子式:C11H18N202简称H7;4-羟基脯氨酸-亮氨酸,分子式:C11H18N203简称H10;4-羟基脯氨酸-苯丙氨酸,分子式:C14H16N203简称H7;L-2-羟基脯氨酸-苯丙氨酸,分子式:C14H16N203简称H12。2、本研究用来评价海洋小分子物质抗乙肝病毒作用的体外系统为HepG2.2.15细胞系:HepG2.2.15细胞出现贴壁后,观察6天内其培养上清液中的HBsAg和HBeAg出现生长及分泌情况,一切正常后视为模型建立成功。3、海洋天然活性小分子物质对HepG2.2.15细胞的毒性作用的评价方法:将小分子物质配置成 20mM,10mM,5mM,2.5mM,1.25mM,0.625mM 6个浓度梯度,将拉米夫定(阳性药物对照)配制成1mM;HepG 2.2.15细胞以1×107个/L接种于96孔培养板,等待细胞贴壁,然后分别将不同浓度组及正常组药物置入不同含药培养液。加药培养6天后,吸去上清液,加5g/LMTT20μL,在37℃孵育4h,震荡10min,测A490nm值,之后通过计算得到细胞抑制率和TC50。4、细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的测定方法:将选取的20种化合物用DMSO溶解后再以1640完全培养液培养液稀释,分别配制成20mM,10mM,5mM,2.5mM,1.25mM共5个浓度梯度(DMSO终浓度不超过0.1%),同时设阴性对照组(仅加细胞培养液)和阳性对照组(1mM拉米夫定),每组设3个复孔。经传代后取对数生长期状态良好的细胞,调整细胞浓度为1×107个/L,接种于96孔板,每孔200μL,培养箱培养24h,待细胞贴壁后各药物浓度组换入相应含药培养液,阴性对照组换入正常培养液,分别收集贴壁后d3和d6的细胞培养上清,-20℃保存,ELISA法对第3、6天上清液中HBsAg和HBeAg进行检测,出现显色反应后,利用酶标仪读取A450nm值;然后通过公式计算,得到抗原抑制率和50%药物抑制浓度(IC50)。5、细胞培养上清液中HBVDNA的测定。按照实验方法4得到第3、6天上清液,按照HBVDNA定量测定PCR试剂盒说明书进行常规操作。得到HBV DNA定量的结果,计算HBV DNA抑制率和IC50。结果:1、HepG2.2.15细胞出现贴壁后,6天内其培养上清液中的HBsAg和HBeAg出现生长及分泌情况稳定增长。2、0.625mM的化合物对细胞的抑制与阴性对照组差异无统计学意义;20mM的化合物和1mM拉米夫定组在细胞毒性上差异无统计学意义。3、小分子化合物对HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用:本研究共评价了 20种海洋天然小分子化合物。其中H5大于2.5mM浓度以上在d3和d6上清液中的HBsAg与阴性对照组的差异均具有统计学意义;H5大于2.5 mM浓度以上在d3和d6上清液中的HBeAg与阴性对照组的差异均具有统计学意义(P<0.05)。第6天,H5对HbsAg和HbeAg的IC50分别为11.6mM和12mM,其TI分别为2.1和2;H10大于2.5mM浓度以上在d3和d6上清液中的HBsAg与阴性对照组的差异均具有统计学意义;H10大于2.5 mM浓度以上在d3和d6上
