关键词：
产气荚膜梭菌
耐药性检测
基因组学
拉曼光谱
摘要：
产气荚膜梭菌是厌氧革兰氏阳性杆菌,能够产生芽孢,是人类和各种动物（包括狗和猫）肠炎和肠毒血症的常见病因。以往的研究表明,不同来源的产气荚膜梭菌菌株往往对多种抗生素（包括甲硝唑等一线抗厌氧菌药物）表现出耐药性或敏感性降低。多项研究显示其耐药形势严峻,耐药及多重耐药问题日益突出,进行抗生素耐药性监测对于评估该细菌抗生素耐药性引发的公共安全风险具有重要的参考价值。传统的抗菌药敏试验（Antimicrobial susceptibility test,AST）方法基于培养一般耗时较久,当前,临床上急需一种更为快捷的新方法用于细菌耐药性的有效监测。本研究分离鉴定产气荚膜梭菌,并研究了六种大环内酯类药物（泰万菌素、罗红霉素、阿奇霉素、替米考星、非达霉素和克拉霉素）对所有菌株的药物敏感性,选择具有特殊表型的10株产气荚膜梭菌进行第二代全基因组测序,并利用基于拉曼光谱与稳定同位素标记相结合的方法,建立产气荚膜梭菌耐药性检测方法。本研究为指导临床“精准用药”提供科学依据,为缓解和遏制细菌耐药性提供更为精准的参考。
1产气荚膜梭菌分离鉴定和抗菌药敏试验
从华中三省（湖北省、湖南省和江西省）不同地区的猪、鸡屠宰场和养殖场采集肠道样品,用无菌棉拭子采集肛门拭子样品,增菌传代纯化后,划线于强化布氏血琼脂平板,对产生双层溶血环的圆形光滑单菌落进行鉴定。利用PCR技术和微生物质谱仪等方法,分离鉴定102株产气荚膜梭菌。采用微量肉汤稀释法检测临床分离产气荚膜梭菌对6种抗菌药（泰万菌素、罗红霉素、阿奇霉素、替米考星、非达霉素和克拉霉素）的耐药情况,获得其MICs分布范围。目前针对这6种抗菌药均没有耐药判定折点,因此,根据MIC90进行数据的处理分析。MIC≥MIC90,判定为耐药,MIC90,判定为敏感。得到临床分离产气荚膜梭菌对泰万菌素、罗红霉素、阿奇霉素、替米考星和克拉霉素的耐药率分别为26.21%、28.16%、39.81%、23.30%和18.45%,其中对阿奇霉素的耐药率最高。
2全基因组测序分析
利用全基因组测序技术对9株临床分离株和1株标准菌CVCC2030进行测序,对其菌株基因组基本特征及潜在功能基因进行分析。所有菌株存在较多的可移动元件片段。进行毒力基因和耐药基因预测,发现部分菌株含有四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类、林可酰胺类等抗生素耐药基因。同时预测出CVCC2030和7株临床分离株为A型产气荚膜梭菌,2株临床分离菌株为C型产气荚膜梭菌。
所有产气荚膜梭菌菌株毒力因子主要集中在免疫调节（Immune modulation）、营养/代谢因素（Nutritional/Metabolic factor）、粘附性（Adherence）方面,菌株的安全性有待进一步考量。
3基于拉曼光谱的药敏检测
（1）重水浓度及时间探究。将产气荚膜梭菌标准菌株CVCC2030与不同浓度梯度（0%、25%、35%、50%）的重水共孵育,在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h时间段分别进行取样,反复离心重悬清洗后点样于Ca F2基片上,测定CD-ratio变化情况,绘制曲线。测试了产气荚膜梭菌标准菌株CVCC2030生长对培养基中D2O浓度的敏感性。产气荚膜梭菌CD-ratio在0～50%重水浓度区间随着时间增加而呈现上升趋势,且重水不对其产生抑制,可以将条件定为重水浓度50%,时间2 h。这一步对产气荚膜梭菌Raman-D2O检测方法的建立进行了初步的摸索。
（2）重水饲喂单细胞拉曼光谱药敏实验。测定与不同浓度泰万菌素、50%重水共培养的产气荚膜梭菌CVCC2030和J5的C-D ratio。J5的C-D ratio所占比基本偏高,CVCC2030的C-D ratio所占比较低,且均低于不加药的阳性对照组,表明J5菌株在0μg/m L～16μg/m L泰万菌素作用下仍有活跃的代谢,而CVCC2030的菌株代谢活性则被抑制。根据TYL对103株产气荚膜梭菌的MIC50和MIC90分别是1μg/m L和4μg/m L的结果所示,J5为TYL耐药菌,CVCC2030则对TYL敏感。其中微量肉汤稀释法所测得的CVCC2030和J5对泰万菌素的MIC分别为0.5μg/m L和>128μg/m L。与传统MIC方法比较,拉曼光谱可以有效区分敏感菌和耐药菌,但是依然存在一些缺陷需要优化完善。
本研究提供基准数据,建立更快的方法检测***耐药性。为指导临床“精准用药”提供了科学依据,为缓解和遏制细菌耐药性提供科学参考。
