关键词:
漆酶
醇氧化酶
酶级联
生物催化
2,5-呋喃二羧酸
摘要:
传统塑料行业的发展及石油基塑料制品的广泛使用,目前产生的白色污染对生态环境造成了严重危害。开发绿色、环境友好的生物基塑料是未来缓解白色污染的关键。聚2,5-呋喃二羧酸乙二醇酯(PEF)较聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)具有更高的热稳定性、更好的机械强度,以及较好的气体阻隔性能和可循环利用性。因此,如何高效制备PEF合成的关键前体物2,5-呋喃二羧酸(FDCA)是突破PEF产业化的关键。基于化学法催化5-羟甲基糠醛(HMF)合成FDCA需要高温、高压、贵金属催化剂,且产物回收复杂。基于多酶级联的生物合成法具有反应条件温和、环境友好、产物纯度高等特性。然而,多酶级联反应中不同酶之间最适反应条件的不匹配,导致相互之间催化过程兼容性下降,制约了酶法制备FDCA的规模化应用。基于此,本课题以短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)来源的漆酶(BpLac)与盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosporioides)的醇氧化酶(CglAlcOx)为研究对象,分别探究了漆酶和醇氧化酶对HMF及其衍生物的转化能力,发现基于漆酶和醇氧化酶设计的双酶级联反应体系,可以将HMF高效转化得到FDCA。全文主要结果如下:
(1)通过分析BpLac分别催化HMF,以及HMF的氧化衍生物5-羟甲基-2-呋喃羧酸(HMFCA)、2,5-二甲酰基呋喃(DFF)和2-甲酰基-5-呋喃羧酸(FFCA),发现BpLac能在24 h将5 mM HMF完全转化为HMFCA,1H-NMR分析表明转化产物中没有DFF产生,说明对HMF的选择性为100%。BpLac不能将HMFCA和DFF氧化为下游产物FFCA。BpLac可以催化FFCA转化为终产物FDCA,经过120 h反应,5 mM FFCA的转化率是5.5 mg/L/h,FDCA的产率是94.94%。
(2)通过分析CglAlcOx分别催化HMF以及氧化衍生物,发现CglAlcOx可以催化HMF转化为DFF,以5 mM HMF为底物,经过24 h反应,DFF产率为45.35%。CglAlcOx能够氧化HMFCA,生成FFCA和FDCA,以5 mM HMFCA为底物,随着HMFCA含量的降低,中间产物FFCA的产率在24h时达到15.57%,CglAlcOx处理120 h后,FDCA产率达到12.07%。CglAlcOx也可以催化FFCA转化为终产物FDCA,经过120 h反应,5 mMFFCA的转化率是5.2 mg/L/h,FDCA的产率是89.12%。
(3)成功构建了含有BpLac与CglAlcOx的双酶级联系统。反应通过两步法进行,经过168h的催化反应,由5 mMHMF转化得到4.88mMFDCA,FDCA产率为97.5%,转化率为5.3 mg/L/h。通过1H-NMR分析表明,级联反应产物单一,BpLac与CglAlcOx的双酶级联系统可行。值得注意的是,在双酶级联催化反应中,CglAlcOx催化HMFCA产生FFCA的能力显著高于单一 CglAlcOx催化的结果,猜测中间产物FFCA和产物FDCA在HMFCA氧化过程中抑制CglAlcOx活性。
(4)设计实验验证了在HMFCA氧化过程中,FFCA对CglAlcOx活性有抑制作用。且证明了 BpLac可以缓解FFCA对CglAlcOx催化活性的抑制作用,提高HMF向FDCA转化的效率。进一步通过分子对接分析CglAlcOx-HMFCA、CglAlcOx-FFCA和BpLac-FFCA结合的关键残基和相互作用,解析了BpLac缓解抑制作用的机制。结果表明BpLac活性位点的3个Arg残基参与了与FFCA的结合,推测BpLac 可能降低了CglAlcOx与FFCA的结合,氧化FFCA生成FDCA,从而缓解抑制作用。
综上所述,本课题建立了适配性较好的双酶级联催化体系,有效地将HMF转化为FDCA,发现了多酶催化体系中,BpLac能够缓解中间产物对CglAlcOx活性的抑制,提高反应效率。以上研究成果为生物合成FDCA提供了理论基础。