关键词:
1,3-二羟基丙酮
灌流培养
中空纤维膜
固定化细胞
动力学模型
摘要:
1,3-二羟基丙酮(1,3-Dihydroxyacetone,DHA)是一种很有价值的化学品,在制药、化妆品和食品等行业中有着广泛的应用,也是有机合成中非常重要的中间体。现在工业上DHA的主要生产方法是利用微生物催化甘油转化,常用的生产工艺是分批补料发酵、静息细胞法、固定化细胞法等。但是高浓度的产物会对菌体产生抑制作用,抑制细胞的生长和生物催化过程。虽然之前报道的研究对DHA的生产工艺进行优化与创新,但是产物的抑制作用一直都是无法避免的问题。本论文采用灌流技术的思路,建立连续化灌流发酵工艺。不断往生物反应器中流加新鲜的底物甘油,同时通过中空纤维柱不断过滤出含有DHA的溶液,将反应器中DHA的浓度控制在70 g/L以下,依此来减轻其对菌体的抑制作用,从而来实现DHA长时间的高效率生产。本文的主要研究结果具体如下:
首先,本文根据灌流技术和恒化器法的理念设计一种新的发酵工艺,即连续化灌流发酵工艺。相比于传统的分批补料发酵,灌流发酵可以将发酵时间延长一倍,同时将DHA的产量从211.6 g增加到368.4 g,提升74.1%。后续对细胞活力的持续时间进行研究,发现定期补加一定体积的再生培养基可以延长细胞催化能力的持续时间。因此在连续化灌流发酵工艺中增加再生操作,将工艺的生产时间延长到264 h,DHA产量增加到726.3 g,较之前提升97.1%。
其次,对建立的连续化灌流发酵工艺进行优化与改进。优化甘油的补料浓度,确定最优的补料浓度,即50 g/L。随后根据已报道的关于DHA生产的动力学研究文献和相关书籍中关于恒化器法的内容,结合连续化灌流发酵工艺的实际运行情况构建相对应的动力学模型。利用动力学模型对工艺运行参数进行优化与模拟,得到了工艺运行条件的最优值,提升工艺的运行效率。最终将发酵时间延长到360 h,共生产1162.4 g DHA。
然后,对DHA的纯化进行研究,发现溶液中的残余甘油会影响DHA的结晶。随着溶液中残余甘油浓度的升高,DHA开始结晶的时间会逐渐延长,同时其结晶率和晶体的纯度也在降低。因此在进行灌流发酵时,为降低残余甘油浓度从而避免影响后续的结晶工作,在工艺中加用固定化细胞来处理未耗尽的甘油。经固定化细胞处理后,甘油的浓度降至1 g/L左右,转化率从原先的93.3%提升到97.7%。
最后,针对细胞再生、灌流工艺分别选取两个时间点进行转录组学的分析,对其中的作用机制进行研究。对比分批补料发酵工艺与连续化灌流发酵工艺之间的差异表达基因,利用生物信息学的方法对其富集分析,发现显著差异基因主要分布在与细胞膜和能量相关的系统中,如ABC转运系统、蛋白电控通道、葡萄糖6-磷酸代谢过程等。分析结果表明灌流工艺可能是通过影响细胞的物质转运,减少代谢废物或其他物质对细胞的毒害作用,从而实现长时间、高效率的生产。同时也对比添加再生培养基前后的差异表达基因,发现胞内的氧化还原能力有所提升。NADH脱氢酶活性、ATP相关合成蛋白、电子传递链、糖原代谢等都有不同程度的提升,表明再生培养基能增强细胞的能量产生能力和细胞内氧化还原能力。