关键词：
动物园
mcr-1
blaNDM
tet(X4)
宏基因组
摘要：
多粘菌素、碳青霉烯和替加环素作为治疗多重耐药菌感染的“最后一道防线”,对临床治疗具有重要的意义。然而,随着这三类抗生素的使用,质粒介导的耐药基因mcr-1、bla NDM、tet（X4）在人类、动物和环境中的出现与传播,已成为全球公共卫生领域面临的重要挑战。关于mcr-1、bla NDM、tet（X4）的研究主要聚焦在家禽和家畜等食品动物,针对动物园观赏动物中耐药基因的研究相对较少。动物园作为人与动物互动的场所,一旦动物携带耐药菌,会存在耐药菌通过接触传播给人类的潜在风险,从而对人类健康造成威胁。因此,本研究通过耐药表型测定、全基因组与宏基因组测序和生物信息学分析的方法,探究了动物园动物及其周围环境中分离的mcr-1、bla NDM、tet（X4）阳性菌的流行特征与传播机制,并进一步研究了动物粪便中耐药基因的多样性与流行规律,以期为动物园细菌耐药性风险评估提供更多数据支撑。
2022年9月,从江苏省某动物园（动物、环境）采集的188份样品中分离到120株mcr-1、bla NDM、tet（X4）阳性菌,包括mcr-1阳性菌、bla NDM阳性菌、mcr-1和bla NDM共存菌、tet（X4）阳性菌,样品阳性率分别为8.5%、6.9%、6.9%、16.0%。大多数阳性菌来源于动物粪便样品,主要宿主为虎和狼。菌属鉴定结果表明,所有阳性菌都属于肠杆菌科细菌,大多数为大肠杆菌（110/120）,少数为肺炎克雷伯菌（8/120）和阴沟肠杆菌（2/120）。药敏试验结果显示,92.5%的阳性菌为多重耐药菌,并且对氯霉素和氨苄西林普遍耐药。接合试验结果表明,57.1%、63.4%、44.8%的mcr-1、bla NDM、tet（X4）能够接合转移。
随后,本研究通过全基因组二代测序和生物信息学分析,重点研究了76株mcr-1、bla NDM、tet（X4）阳性菌的基因组遗传特征,以深入追踪阳性菌的基因组进化特征与传播路径。基于核心基因组SNPs进化分析发现,ST48、ST46型bla NDM-5阳性大肠杆菌和ST1433、ST58型tet（X4）阳性大肠杆菌在不同来源的宿主中克隆传播。此外,通过结合128株全球mcr-1和bla NDM共存大肠杆菌的基因组数据与进化分析发现,ST167和ST69型大肠杆菌在动物园动物与人类之间存在交叉传播的可能性。为深入探究mcr-1、bla NDM、tet（X4）的传播机制,本研究进一步筛选了29株阳性菌进行纳米孔三代测序,并基于获得的完整基因组图谱分析了mcr-1、bla NDM、tet（X4）阳性质粒结构与核心遗传环境。结果发现,mcr-1、bla NDM、tet（X4）阳性质粒类型具有多样性,其中IncI2、IncB/O/K/Z和IncX1质粒分别是携带mcr-1、bla NDM、tet（X4）的优势质粒类型。值得注意的是,本研究首次发现了bla NDM-5阳性IncN-IncX1融合质粒,该质粒具有接合转移的能力,可以介导bla NDM-5的传播。此外,mcr-1核心遗传结构中的ISApl1,bla NDM核心遗传结构中的IS1294、ISCR1、IS26和IS3000,tet（X4）核心遗传结构中的ISCR2和IS1,也与相应耐药基因的水平转移有关。
基于单菌基因组学的研究主要聚焦在mcr-1、bla NDM、tet（X4）的流行特征与传播机制,而动物园中其他耐药基因的流行规律尚不明确。随后,本研究采用了宏基因组学来探究动物园动物中耐药基因的多样性与流行规律,探索其作为耐药基因储存库的潜在风险。结果显示,动物粪便中共鉴定出1,415个耐药基因,其中四环素类和多药外排基因最丰富。此外,耐药基因的分布与动物宿主的饮食结构、微生物的组成结构和可移动遗传元件的分布有关。重要的是,质粒介导的多粘菌素、碳青霉烯和替加环素耐药基因在肉食动物中流行,提示这些动物的肉类饲料可能携带耐药菌,并且存在耐药基因向动物转移的风险,应加强对肉类饲料的质控。耐药基因的丰度与埃希氏菌属（优势菌属）的丰度呈正相关,提示耐药基因可能在动物源埃希氏菌属中广泛流行。
综上,本研究揭示了动物园中mcr-1、bla NDM、tet（X4）阳性菌的流行特征与相关传播特征,其中部分ST型bla NDM-5阳性大肠杆菌和tet（X4）阳性大肠杆菌在动物园中的克隆传播;ST167和ST69型mcr-1和bla NDM共存大肠杆菌在动物与人类之间的传播;新型IncN-IncX1融合质粒介导bla NDM-5的传播未来值得密切监测。随后,本研究通过宏基因组学进一步扩展了对动物园动物中耐药基因的多样性与流行规律的理解,其中可转移耐药基因在肉食动物中流行,提示应进一步加强对肉类饲料的质控。本研究从耐药单菌和耐药组两个角度明确了动物园耐药性风险,
