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关键词： 氧化苯乙烯异构酶   布洛芬   苯乙醛   生物催化   多酶级联反应   定向进化  

摘要： 非甾体抗炎药物布洛芬和苯乙醛类化合物在医药、香料、农药等多个领域具有广泛的市场需求。然而,当前的化学合成工艺存在高能耗、高污染等问题,不仅对环境造成了破坏,也限制了这些化合物的可持续生产与发展。为寻求解决之道,本研究计划开发两条多酶级联路线,旨在为布洛芬和苯乙醛类的绿色生产提供创新的解决方案。在上述路线中,限速步骤是氧化苯乙烯异构酶(SOI)催化的反应。SOI是一种具有独特催化功能的膜蛋白,能催化芳基环氧化物的Meinwald重排转化为羰基化合物。考虑到SOI在反应路线中的核心作用及其对整体反应速率的限制,对其进行定向进化以优化其催化性能。 首先,为了便于筛选SOI突变体,本研究成功构建了针对醛类的高通量筛选体系。通过单位点饱和突变和高通量筛选技术,对SOI的100个氨基酸残基进行了系统性的突变和筛选。经过单轮定向进化,成功获得了位于膜外区域的突变体SOI(E52T),该突变体在催化2-(4-异丁基苯基)-2-甲基环氧乙烷的异构化-氧化级联反应中表现出优异性能,使布洛芬的合成产率由原来的20%大幅提升至近70%。为了深入理解SOI的催化机制,本文结合Alpha Fold 2预测的同源结构信息,对SOI的活性口袋进行了初步探索。通过对E52及其附近残基构建突变体库并筛选,发现单个SOI蛋白可能无法形成完整的催化口袋,而需要多个SOI蛋白结合形成多聚体结构。 对于布洛芬的生物催化合成,本文开发了基于SOI(E52T)和醛脱氢酶催化的异构化、氧化的一锅两步级联反应。通过系统考察不同催化条件对异构化-氧化级联反应的影响,发现纯水相体系相较于两相反应体系更能促进2-(4-异丁基苯基)-2-甲基环氧乙烷转化为布洛芬。同时,也优化了缓冲液的p H和反应温度并进一步提高了转化率。此外,还通过调整三种酶在不同质粒载体上的排列组合和细胞浓度配比,进一步提高了多酶级联反应的转化率。在最佳条件下,经24 h催化10mmol/L 2-(4-异丁基苯基)-2-甲基环氧乙烷合成布洛芬的转化率最高可接近70%。 此外,还开发了基于苯乙烯单加氧酶和SOI催化的环氧化、异构化的一锅两步级联反应,将各种取代型苯乙烯转化为相应的苯乙醛类。通过优化反应条件,发现两相反应体系能更好地减缓苯乙烯的挥发,促进产物转移以降低可能存在的产物抑制,从而提高转化率。同时,适当的p H、反应温度和辅酶再生系统也提高了级联反应的转化率。在最佳条件下,经24 h催化10 mmol/L苯乙烯合成苯乙醛的转化率最高可接近62%。此外还系统地评估了在最佳反应条件下全细胞催化剂对各种取代型苯乙烯的转化效率。结果显示取代基位置和分子结构对反应存在一定影响,但多种取代型苯乙醛得以生产,其转化率最高可达70%。 然而,随着底物浓度的提高,两条级联反应的转化率均出现了显著下降。这表明在高底物负载下可能存在底物抑制以及两条级联通路里关键酶的催化效率不够。为了提高转化率,需要进一步提高关键酶的催化效率,并探索优化反应条件的方法,如开发新的辅酶再生体系、改进细胞表达系统等。 综上所述,本研究通过构建高通量筛选体系、定向进化关键酶以及优化级联反应条件等策略,成功开发了两条基于SOI的多酶级联反应合成布洛芬和苯乙醛两类重要的芳香族分子。本研究为制药和香精香料行业的可持续发展提供了绿色环保和具有较高经济效益的多酶级联反应路线。这一成果不仅具有潜在的应用价值,也为酶催化级联反应的设计和优化提供了新的思路和方法,有望为我国的绿色生物制造和可持续发展贡献力量。

摘要： 植物功能基因组学与发育调控湖南省重点实验室由湖南省科技厅2013年批准,依托湖南大学生物学院建设与开放,是湖南大学“985工程”“211工程”重点建设科技创新平台和湖南省“2011协同创新中心”的重要组成部分,为最初建立于2001年的湖南大学植物生物技术实验室发展而来,2021年被评选为湖南省优秀重点实验室,实验室主任为刘选明教授。

关键词： 第四纪冰期   走出青藏高原   冰清绢蝶   比较基因组学   群体遗传学   转座子   局部环境适应  

摘要： 全球环境变迁与物种演化是当前进化生物学关注的一个热点问题。尤其是在第四纪冰期气候变化驱动下,众多生物类群走出青藏高原,并扩散至亚洲、欧洲及北美洲等地,对整个北半球生物多样性的形成产生了重要影响。然而,这些高山类群“走出青藏高原”及其局部环境适应的进化基因组学机制则知之甚少。 绢蝶属（Parnassius）是一类隶属于鳞翅目凤蝶科的典型高原蝶类,同时也是基因组最大的蝶类类群。早期关于绢蝶起源与演化的相关研究表明,它们是在新生代早中新世（距今21～17百万年前）青藏高原造山运动这一复杂的地质环境演变背景下形成并快速辐射至北半球的典型昆虫类群之一。在漫长的进化过程中,绢蝶不仅保留了分布在青藏高原的众多高海拔土著物种,同时还存在少数扩散至欧洲、北美洲以及东亚（主要中国中东部）的中、低海拔物种。特别是冰清绢蝶（Parnassius glacialis）,以前研究表明它是唯一经过中国西北、华中和华东等温带地区并在第四纪冰期时扩散至长江以南的绢蝶物种,为我们探讨“走出青藏高原”昆虫类群的基因组进化与群体演化提供了理想的研究对象。 本研究主要以一个较低海拔分布的绢蝶物种（冰清绢蝶）为研究对象,通过Denovo基因组测序以及9个不同海拔群体（300～1800 m）的重测序,利用比较基因组与群体遗传学等方法,分析了冰清绢蝶的庞大基因组形成、基因家族扩张、群体遗传结构、种群历史动态以及选择性清除模式,并着重探讨了转座子（Transposable element,TE）在基因组组成、基因重复、群体遗传分化以及选择性进化中的关键作用,为第四纪冰期高山类群“走出青藏高原”的进化适应提供新的见解。本研究的主要结果如下: 1.中国10种不同海拔绢蝶物种的基因组大小评估 本研究基于基因组Survey测序,评估了不同海拔分布（300～5000 m）的中国10种代表性绢蝶属物种的基因组大小。结果发现,绢蝶的基因组大小主要介于1.00～1.90 Gb之间,并且与海拔分布有一定关系。其中,分布在青藏高原高海拔地区（主要在3000～5000 m左右）的蓝精灵绢蝶（***）、安度绢蝶（***）、西猴绢蝶（***）、君主绢蝶（***）与珍珠绢蝶（***）的基因组大小约为1.0～1.22 Gb,而“走出青藏高原”的中、低海拔分布（主要在300～3000m左右）的小红珠绢蝶（***）、白绢蝶（***）、阿波罗绢蝶（***）、羲和绢蝶（***）与冰清绢蝶（***）的基因组大小普遍介于1.27～1.90 Gb之间。总之,与青藏高原土著绢蝶相比,“走出青藏高原”的绢蝶物种普遍拥有更大的基因组。 2.冰清绢蝶的基因组组装及其基因组大小形成机制 本研究基于Pac Bio测序以及Hi-C测序,完成了冰清绢蝶的染色体水平基因组组装与注释。基因组组装结果显示,冰清绢蝶基因组约为1.35 Gb,主要由29条染色体组成,其Contig N50长度为6.45 Mb,Scaffold N50长度为49 Mb,BUSCO完整性达到了95.8%。基因注释结果显示,冰清绢蝶中共鉴定到17,080个蛋白编码基因,平均转录本长度约为21.08 kb,平均内含子长度为4.52 kb,平均外显子数量为5.37个。与近缘凤蝶属蝶类相比,冰清绢蝶基因有着更长的转录本、更长的内含子以及较少的外显子数量。重复序列注释结果显示,冰清绢蝶基因组中大约含有971 Mb的重复序列（占71.8%）,是已知重复序列占比最高的蝶类物种之一。其中,LINE、DNA、LTR、SINE和Helitron转座子在冰清绢蝶基因组中分别约占38.9%、10.64%、6.28%、3.40%和4.38%左右。 结合已公开的珍珠绢蝶（3000～5000 m）和阿波罗绢蝶（800～3000 m）基因组,本研究进一步分析了3种绢蝶中转座子的Kimura分布以及插入时间,并评估了LTR反转座子的不等重组率（Solo-LTRs/complete LTRs）。结果发现,转座子活动在3种绢蝶中的爆发时间主要集中在第四纪（约3 Ma以内）。尤为注意的是,此次转座子爆发事件主要涉及少数几种类型的转座子,包括LINE/RTE、LINE/CR1、LTR/Gypsy和LTR/Pao等。由此推测第四纪冰期与间冰期旋回气候变化可能激发了转座子的爆发,使得绢蝶属成为基因组最大的蝶类类群。同时,“走出青藏高原”的冰清绢蝶和阿波罗绢蝶的LTR反转座子不等重组率分别为1.15和0.08,远远小于分布在青藏高原高海拔地区的珍珠绢蝶2.67。这表明高海拔分布的珍珠绢蝶通过较高转座子不等重组率在一定程度上抑制了基因组的增加,而中、低海拔分布的冰清

摘要： 随着消费者护肤需求的日益增长，功能性护肤行业迅速扩张。近年来，北京同仁堂麦尔海生物技术有限公司加紧布局功能性护肤赛道，力争占据更有利的市场地位。2023年2月，北京同仁堂麦尔海生物技术有限公司通过北京产权交易所以增资扩股方式引入投资方健之佳医药连锁集团股份有限公司，募集资金3334.5万元。此次增资扩股在实现公司实现股权多元化的同时，有利于推动企业资源整合和改革创新。也为助力老字号创新发展提供了可复制、可推广的有益经验。

关键词： 生物技术  

ISBN: (纸本)9787522136615

摘要： 本书以基本理论、知识、技能以及思想性、科学性、先进性、知识性为目标，围绕生物化学技术的基本理论及其在实践中的应用两部分内容进行介绍，主要介绍了层析技术、离心技术、电泳技术、聚合酶链式反应、生物工业下游技术、色谱-质谱联用技术、生物纳米技术等技术原理及其应用。

关键词： 生物质   木质素   催化转化   自转移氢解   β-O-4键  

摘要： 木质素是自然界最丰富的可再生芳香碳资源,但目前远没有实现高效利用。由于传统氢解木质素的方法不仅会因为使用大量的“灰氢”导致二氧化碳排放,也会带来生产安全等问题。因此,开发无外源氢气下木质素转化制备重要化学品具有重要意义。β-O-4键是木质素中含量最高的连接键,其高效活化转化对实现木质素高值化利用至关重要。本论文主要研究木质素中β-O-4键的催化转化机理,设计高效催化体系,发展无外源氢气下木质素及其相关模型化合物的高效定向转化为芳香含氧化合物的方法。主要研究内容和创新点如下: 1.采用沉淀法合成了Ni OOH催化剂,该催化剂能够在无添加剂和无外源氢气的条件将木质素模型化合物2-苯氧基-1-苯乙醇高效催化转化为苯酚和苯乙醛。系统考察了反应温度、反应时间等因素对催化性能的影响。在优化的反应条件下,苯酚和苯乙醛的收率分别为63.9%和34.6%。机理研究表明,反应底物经Cα-OH的消除得到烯醚中间体,烯醚中间体进一步水合异构为苯酚和苯乙醛。 2.以硝酸铈、硝酸锆和柠檬酸为原料,通过溶胶凝胶法制备了铈锆固溶体,用于催化木质素β-O-4键的活化转化。研究发现,热解温度对所制备的铈锆固溶体的催化性能有显著影响。其中,600℃制备的Ce0.8Zr0.2O2具有良好的催化活性,能够将β-O-4模型化合物2-苯氧基-1-苯乙醇转化为苯酚和苯乙醛,收率分别可达69.0%和38.0%。此外,该催化剂还能有效催化天然木质素解聚为2-甲氧基-4-乙基苯酚、4-乙基-2,6-二甲氧基苯酚等芳香族化合物。 3.利用浸渍法成功制备了一系列Pt基催化剂,研究了它们对天然木质素及模型化合物的自转移氢解反应的催化性能。系统考察了催化剂载体种类、Pt担载量、反应温度、溶剂种类与用量、催化剂用量等因素对β-O-4键断裂的影响。其中,1 wt%Pt/Al2O3-acid（酸性Al2O3）能够高效催化β-O-4模型化合物2-苯氧基-1-苯乙醇转化为苯酚和苯乙酮,收率分别为88.4%和76.6%。Pt纳米颗粒良好的分散性以及担载Pt后载体氧空位数量的增加是催化剂高性能的重要原因。机理研究表明,反应的主要路径为2-苯氧基-1-苯乙醇中的Cα-OH脱氢生成Cα=O,原位生成的氢在Pt上形成氢池,进一步促进醚键断裂。 4.通过金属有机框架材料Ni-MOF的热解,合成了一系列碳负载Ni基催化剂Ni/C-（x）(其中x为热解温度),用于木质素的自转移氢解反应。研究发现,热解温度对催化活性有很大影响。其中,500℃热解萘二甲酸为配体制备的Ni-MOF所得到Ni-NDC-500催化剂的催化活性最高,能够高效催化天然木质素和多种木质素β-O-4模型物的转化。其中,催化从桉木提取的木质素转化可以获得10.4%的芳香族化合物收率,具体产物有苯酚、愈创木酚、2-甲氧基-4-乙基苯酚、4-乙基-2,6-二甲氧基苯酚等。通过对比实验和同位素标记实验,验证了自转移氢解反应的机理:Cα-OH脱去氢转化为Cα=O,原位生成的H进一步促进醚键的断裂。

关键词： 黑龙江流域   达斡尔人   洪河遗址   明代   古基因组学  

摘要： 黑龙江流域生态环境多元多样、自然资源丰富,早在旧石器时期便有人类居住。不同文化的人类族群在此生息繁衍,不断发展自己族群文明成果的同时共同创造了黑龙江流域多元丰富的古代文化。黑龙江诸人类族群使用不同语系语族语支的语言,如通古斯语、蒙古语、满语、汉语等,在此居住的本地土著族群可分为三大族系,包括肃慎、东胡和秽貊,都曾对中国北方的政治、文化产生了重要的影响。 现代黑龙江流域的土著族群之中,达斡尔人作为使用蒙古语族语言又与邻近通古斯语族鄂温克人、鄂伦春人泛称索伦部的独特存在,时常成为人类遗传学研究中的热门探讨对象,有关达斡尔人遗传起源的探讨数百年来经久不衰。为探究达斡尔人的遗传起源和其他黑龙江流域土著人群的遗传联系,本研究选取了位于黑龙江流域西部齐齐哈尔市杜尔门沁达斡尔族乡洪河遗址的明代古人类样本作为实验对象进行古基因组学的研究,期望通过群体遗传学分析的方法,探究于明代生活在此地的黑龙江古人的遗传面貌以及与现今居住在本地的达斡尔人的遗传联系。在本研究中还对达斡尔人遗传起源的相关学说进行探讨,将已发表的古代契丹人基因组纳入到人群遗传结构的研究中,以检验有关达斡尔人的契丹起源假说。本研究还将明代洪河人群与其他黑龙江流域明代人群进行遗传学分析比较,以探索明代黑龙江流域发生的人口迁徙和遗传交流事件,为现代黑龙江本地族群的形成提供生物遗传学的见解。 本研究中共成功提取27个洪河遗址明代古人类的基因组数据,包括11名男性个体和16名女性个体。明代洪河人群的单亲遗传标记呈现出多源流的特点,多数单亲标记类型属东亚北部和东北亚常见类型,少数属东亚南部和东南亚常见类型。核基因组的群体遗传学分析表明明代洪河人群起源于黑龙江流域早期人群基因库,但在族群发展的历程中受到邻近西部蒙古高原相关人群和南部汉族相关人群遗传成分的渗入。在人群模型的研究中发现,明代洪河人群可作为现代达斡尔人的祖先成分来源,而契丹人群并不能作为达斡尔人的直接祖先成分来源。对不同黑龙江流域古代和现代人群的遗传分析,发现了历史时期发生于此地区的人群迁徙及遗传交流事件,可能与此时期东北地区的政治、军事、贸易相关。 本研究通过对明代洪河人群的群体遗传学分析,探究出该古代人群的遗传面貌与起源、流向,填补了历史时期黑龙江流域西部人类古基因组学研究的空白,并发现历史时期不同区域生业文化各异的其他人群对黑龙江流域本地族群的遗传影响。同时,通过人群模型的分析,探讨了有关现代达斡尔人的起源学说和人群成分模型,填补了有关达斡尔人遗传研究的空白。

关键词： 酪氨酸氨裂解酶   4-乙烯基苯酚   多酶级联反应   生物催化  

摘要： 4-乙烯基苯酚(4-Vinylphenol,4VP)是重要的化工原料及功能性分子,可用于改善食品风味与稳定性,提高化工产品耐久性,也可用于多种高分子、生物分子的合成。另外4VP也是重要的农用药物分子,可促进果实的成熟、花卉开花、控制植物徒长。近年来研究发现4VP可作为高效杀线虫剂使用,有效抑制线虫卵的发育,在较低浓度下即对线虫有较强的杀灭作用。但4VP的化学生产受制于污染和低效问题,为实现4VP的高效生物法生产,本研究开发了一条双酶级联反应,以生物基的酪氨酸为原料,经全细胞内的氨裂解酶、酚酸脱羧酶级联催化实现。主要结果如下: (1)对限速酶进行重新选择及改造。挖掘潜在酪氨酸氨裂解酶、建立系统发育树,结合总结的酶活规律进行潜在活性判断,挑选出活性最好的约翰氏黄杆菌来源的酪氨酸氨裂解酶Fj TAL,其对酪氨酸比酶活为86.2 m U/mg。同时,发现两个新对酪氨酸底物专一性极强的新酶。通过挑选底物口袋周围12个点进行定向进化,并未实现Fj TAL活性的有效提高,说明该酶在自然条件下进化到了一种相对优势的结构。 (2)双酶级联反应的初步探索。选用活性较好的枯草芽孢杆菌来源的酚酸脱羧酶(Bs PAD)与Fj TAL组成双酶级联反应以酪氨酸为底物生产4VP,经24小时反应,产量达到1.82 g/L。采用癸醇作为有机相进行双相反应,使其24小时内产量提升至2.21 g/L,72小时达7.43 g/L。且反应稳定性好,时空产率达12.0 mg/(h·L)。将级联反应中两个酶构建于同一质粒上,由同一个启动子控制表达,72小时产量提高至13.4 g/L,产量提高80%。 (3)级联反应条件的进一步优化。在上述基础上转入氨基酸转运蛋白(aro P和tyr P)以实现底物酪氨酸的高效传递,相较于未转入转运蛋白的对照组(72小时产量12.4 g/L),额外转入aro P与tyr P的工程菌株分别于72小时实现了30.3 g/L与24.6 g/L的产量。通过T7启动子改造实现酶表达量的调控,含有最佳的启动子组合的工程菌株在48小时内实现了22.4 g/L的产量,相对单一启动子调控的工程菌株13.2 g/L的产量提高了70%。以此为基础,考虑反应的持续性及产物的稳定性,确定以30℃与p H 8.0进行后续的反应。对于用不同培养基进行优化,其中TB培养基的诱导表达效果最佳。为降低成本,在有机相添加比例为水相反应体系的20%条件下,十二酸乙酯对产物4VP有着更好的萃取效果,且不会影响反应效率。结合以上所有优化后的条件进行放大反应,48h产量为19.78 g/L,表明反应效率并未因反应体系的变大而受到影响。以酪氨酸为底物,通过多酶级联成功实现4VP的高效生产,最佳条件下,72小时产量达到31.8 g/L,转化率时空产率达414.2 mg/(h·L)。 本论文采用两步级联催化生产4VP,较短反应路线在保持反应的高效性的同时,避免了对香豆酸的毒性。使用双相反应,避免了4VP的杀菌活性,解除了产物抑制,还使得4VP易于分离同时得到有效的保护。本研究实现了酪氨酸高值化的转变,为多酶级联绿色生物制造的设计与优化提供了新的思路,为4VP的生物法工业化生产奠定了一定的基础,为农业相关行业的发展提供了新思路。