关键词：
脑类器官
细胞接种量
基质胶
空间转录组
酒精暴露模型
摘要：
人的中枢神经系统协调着无数功能和机制,它是一个高度动态和复杂的器官,由于人脑的复杂性和人脑组织的特殊性,研究人的神经系统非常具有挑战性。目前对人类大脑的认识大多是基于死后的大脑标本,很难进行所有发育阶段的研究。虽然对神经系统的研究可以用动物模型来完成,但人类的大脑不仅在大小、形状和结构上不同于其他物种,而且在细胞和分子组成以及发育轨迹上也不同,具有较大的种间差异。因此为了更好地理解大脑机制和人类神经系统疾病的机理,有必要开发与真实大脑结构和功能更为相近的大脑模型,再现人类中枢神经系统的生理特征和反应。体外诱导多能干细胞二维分化,可以重现神经发生的过程,但二维培养条件下细胞会变得扁平,细胞的增殖和生长状况改变,因此要想更为精确地模拟人类大脑的组织结构,需要建立三维的人脑模型。脑类器官是干细胞来源的三维悬浮培养物,具有类似大脑发育时的特征,如脑室区形成、皮层组织和神经元迁移。脑类器官可以更好地概括人类大脑的关键特征,可应用于发育研究、疾病模型建立、药物筛选等领域。但脑类器官仍然只是脑的类似物,其研究尚处于起步阶段,相关的培养体系包括研究手段和应用评估亦在不断探索中,如何高质量培养、评估其特性及应用,尚需要深入研究。因此,本论文探究了脑类器官的培养方法,开发了新型研究手段并探索了其生物医学应用,主要研究内容和结论如下:(1)构建了一种稳定的脑类器官培养方法,探究了细胞接种量对脑类器官异质性的影响。建立了稳定的人胚胎干细胞H9培养体系,培养无污染、分化少、核型正常、干性良好的多能干细胞。基于非定向分化的方法建立了脑类器官培养流程,包括拟胚体形成、神经诱导、神经扩张和类器官成熟四个步骤。免疫荧光染色和定量PCR结果显示在第10天,类器官已成功进行了神经分化;在第36天,脑类器官中已分化出由神经祖细胞形成的类脑室区结构和神经元,并且初步形成了TBR1和CTIP2表达的皮层区域;在第60天,脑类器官由内到外呈现出类脑室区或脑室下区结构、类中间区结构和类前板结构,深浅层神经元分层结构与18孕周人脑结构相似,已发育出谷氨酸能神经元、GABA能神经元和星形胶质细胞。另外,实验结果显示细胞接种量显著影响拟胚体的大小和相关基因表达,说明初始细胞数量是造成脑类器官异质性的原因之一,为后续减少脑类器官异质性提供了重要的参考价值。(2)首次探究了两种基质胶对脑类器官生长发育的影响。Matrigel 356230组脑类器官的大小和神经上皮的相对面积都显著大于Matrigel 354277组,对第10天、第20天和第30天的两组脑类器官进行了转录组分析,差异表达基因数量分别为738、2190和689,在第20天差异表达基因数量最多。GO和KEGG富集结果显示基质胶在不同阶段对脑类器官影响的分子机制不同,其影响PAX6、NEUROG1、ATF2等基因的表达从而影响脑类器官生长和神经分化,结果表明Matrigel 356230更利于脑类器官生长。最后对Matrigel 356230培养的第10天、第20天和第30天的脑类器官进行转录组分析,比较了三个时间点细胞外基质、神经发生和突触传递相关基因的相对表达量,结果表明第30天的脑类器官神经分化程度最高,且在第30天时已经出现了NEUROD2、NEUROD6高表达的兴奋性神经元和DCX高表达的抑制性神经元。(3)建立了一种基于微针采样的脑类器官空间转录组研究方法,并用于脑类器官冰冻切片微区细胞注释。首先优化参数制备出特定直径的微针,使用不同直径的微针对脑类器官切片进行采样,探究了不同微针的采样区域大小及得到的样品中的RNA含量,结果显示使用直径为20μm的微针能得到最佳的采样结果,采样成功率达100%。接着使用该方法对培养至第20天和第60天的脑类器官冰冻切片进行采样后建库测序。生物信息学分析结果表明,培养至第20天和第60天的脑类器官冰冻切片的微区中中间祖细胞的组成无显著差异,前者微区中含有更多的神经祖细胞而后者含有更多的成熟神经元,在前者中星形胶质细胞更倾向于表达SPARC而后者更倾向于表达NTRK2。差异表达基因分析结果表明后者突触活动更频繁、神经发育程度更高。最后,成功绘制了空间注释图谱,可快速地得到每个微区的细胞组成,为进一步探究脑类器官的空间转录组信息、研究脑类器官在三维空间的发育和分化提供了一种新的技术手段。(4)构建了脑类器官酒精暴露模型,探究了不同浓度酒精对脑类器官的影响。形态学观察发现25 m M和50 m M酒精处理组脑类器官的直径显著小于正常组,表明酒精会影响脑类器官生长,即可能引发小头畸形。活死染色结果表明,酒精暴露后的脑类器官死亡的体积显著大于正常组。酒精处理5天的转录组分析结果表明,酒精浓度越大,其相对于正常组的差异表达基因就越多。差异表达基因富集的KEGG通路有逆行神经信号通路、胆碱能突
