关键词:
小头症
类脑器官
力损伤模型
神经修复
Piezo1
摘要:
小头症是一种神经发育障碍,其致病机理和神经损伤机制尚未完全明确,且缺乏有效的治疗措施。小头症最基本的临床表现是头颅周径生长滞后,颅骨形变诱导压应力可直接导致脑组织压缩及神经功能受损,探究压应力调控小头症神经损伤的变化规律对于深刻理解小头症的神经损伤机理和开发有效治疗方法具有重要意义。鉴于人脑发育研究在伦理、检测分析手段等方面的限制,类脑器官由于具有人源特征、3D微环境以及类似大脑的组织结构特征,是探究压应力调控小头症神经损伤变化规律的理想平台。基于此,本论文聚焦小头症中颅骨变形诱导的压应力与神经损伤变化的关系,利用生物力学、神经科学及细胞组织工程手段构建了hi PSC来源类脑器官的小头症可控加载模型,通过设置不同加载梯度探究了压应力与类脑器官生长、接触模量和硬度的关系,以及压应力的传导途径;选取最显著加载间距明确了类脑器官不同脑区的压应力响应规律,评价了小头症特征标志物表达与分布变化。借助转录组分析阐明了压应力调控小头症神经损伤的分子机制。进一步探究了加载再释放和生长因子2种不同方式对损伤类脑器官神经恢复的治疗效果,研究发现加载再释放主要是通过细胞黏附分子及突出引导途径调节压应力神经损伤类脑的细胞重塑和细胞周期,而生长因子可通过PI3K/AKT途径对压应力损伤类脑神经调节,保护神经细胞免受凋亡影响,预示压应力诱导的小头症神经损伤可通过加载再释放及生长因子干预进行有效的治疗。本文主要的研究内容和结论如下:(1)明确了压应力在小头症神经损伤中的作用及调控机制。(1)基于光刻技术及光固化技术制备具有物质交换功能的加载装置,通过设置不同加载梯度探究了压应力与类脑器官生长、接触模量和硬度的关系,随着压应力逐渐增加,类脑生长明显受限,在加载间距为200μm时,类脑面积降低35%,而对于类脑的接触模量及硬度均随压应力增加而增加,且在加载间距为200μm时呈现出显著性差异(p<0.05);(2)采用免疫荧光研究了压应力对类脑器官的传导途径,应力促进机械力通道蛋白Piezo1及细胞骨架actin表达,同时β-catenin表达受到抑制,反映出压应力通过机械力通道蛋白及细胞骨架传导及β-catenin蛋白调控类脑生长抑制;(3)选取最显著加载间距明确了类脑器官不同脑区的压应力响应规律,对类脑六个脑区进行了统计分析发现加载类脑总体表达下降31.65%,其中差异最大的是前脑区域,降低了18.81%;(4)评价了小头症特征标志物表达与分布变化,在加载类脑中发现前脑标识蛋白表达异常,前额叶皮质减小,神经祖细胞整体水平表达降低,纺锤体呈现更多的倾斜及垂直方向,同时增殖能力下降,以及新生神经元表达水平降低;(5)借助转录组分析阐明了压应力调控小头症神经损伤的分子机制,压应力促进力学通道蛋白Piezo1基因上调,及细胞骨架Actin表达上升,并通过Wnt通路进行信息传导,引发前额叶皮质受损及紧密连接蛋白下调,最终导致类脑尺寸减小。(2)再释放有助于压应力导致的小头症神经损伤类脑的神经恢复。基于构建的小头症压应力损伤类脑模型,通过选择加载4 d、15 d及20 d进行释放,借助于共聚焦3D成像、免疫荧光、转录组及RT-PCR技术考察了再释放对于小头症类脑的力学传导途径及释放过程中神经恢复机理。(1)再释放利于小头症压应力损伤类脑的生长发育。再释放显著促进类脑生长,类脑生长在细胞水平具体体现在细胞分裂、增殖能力及凋亡水平,再释放会显著提升小头症类脑的前脑区域的有丝分裂水平。再释放对加载类脑神经源性非增殖分裂最为有利,而对于细胞凋亡,再释放会显著降低细胞凋亡水平,同时再释放后小头症类脑的生长是基于细胞骨架、细胞粘附及压应力通道的机械调节,从而引起细胞增殖能力及凋亡水平的变化,最终导致小头症类脑尺寸的增加;(2)再释放利于小头症压应力损伤类脑基底祖细胞的发生及背侧端脑的自我更新。神经分化初期释放的类脑可见较大的空洞及心室表面连续完整,同时提前释放可显著促进背侧端脑标识蛋白PAX6及紧密连接蛋白表达,反映出提前释放提升了背侧端脑自我更新能力;(3)再释放利于小头症压应力损伤类脑神经祖细胞表达及分化。在加载至第4 d释放可观察到与正常类脑相似的神经祖细胞形态变化,在15 d释放可观察到含大量较成熟神经元的突起神经上皮组织,且在神经分化初期释放对于SVZ中间祖细胞表达最显著;(4)再释放促进小头症压应力损伤类脑新生神经元及成熟神经元的生成。在第4 d释放可达到与正常类脑相近的新生神经元数量,同时在15 d及20 d释放新生神经元数量分别提升13.68%和3.83%,而对于成熟神经元,在加载至第4 d,其表达显著下降,但分布与对照组相似,集中在边缘扩增区域;(5)再释放后小头症类脑通过突触引导及细胞黏附调控细胞循环促进细胞增殖。再释放后轴突导向因子SLIT1大量上调,从而激活