关键词：
简单节杆菌
醋酸可的松
转录表达谱
遗传操作系统
CRISPR/Cas9
非同源末端连接
摘要：
简单节杆菌(Arthrobacter simplex)是目前国内工业上常用的甾体C1,2脱氢反应菌株,其转化醋酸可的松生产醋酸泼尼松的反应是甾体药物生物转化工业生产的典型代表。本文首先对简单节杆菌甾醇代谢进行生物信息学分析、对醋酸可的松(CA)转化过程中的转录表达谱进行分析。通过过表达和串联表达工程菌的构建及性能分析,对候选关键基因的作用进行验证。此外,从同源重组敲除、非同源末端连接、CRISPR/Cas9基因编辑和启动子等角度对简单节杆菌遗传操作系统进行初步研究。首先,使用在线工具MEME预测了简单节杆菌中甾醇代谢调控因子KstR和KstR2的结合基序,其与分枝杆菌中KstR和KstR2的结合基序高度保守。将简单节杆菌中的甾醇分解代谢基因进行聚类分析,结果表明,简单节杆菌甾醇分解代谢基因主要聚集在5个大的基因簇中。对有无底物和不同转化时间下的转录表达谱进行差异分析。结果表明,仅有约十分之一的显著差异表达基因位于甾醇代谢基因簇中,暗示简单节杆菌中可能存在新的转录调控因子调控CA代谢。使用MEME工具预测出三个潜在调控CA代谢的转录因子的结合基序CAin1,CAin2和CAde1。在课题组前期工作的基础上,分析了四个转运相关基因(sufC、mfs、mb1和mb2)和两个酶活调控因子(hsaA和α/β-hyd)对菌株转化性能的影响。结果表明,在CA浓度为15 g/L和8%乙醇助溶的转化体系中,sufC、hsaA和mb1对简单节杆菌的CA代谢起正向调控作用,其中,sufC和hsaA过表达菌株的最大PA生成量(11.81 g/L和11.72 g/L)较对照菌株(9.74 g/L)分别提高了21.26%和20.33%;mb2和mfs不参与调控CA代谢,α/β-hyd对CA代谢起负向调控作用。对转化性能较好的Suf C和Hsa A进行生物信息学分析,结果表明,两者均为胞质蛋白,且与目前报道结构已知的Suf C和Hsa A高度保守。之后,采用模块化工程的思想,将上述筛选得到的对转化反应具有明显正向作用的基因与课题组前期筛选得到的抗逆元件(热激蛋白gro EL)进行串联表达并进行底物转化实验。结果发现,在15 g/L底物CA和8%乙醇助溶体系中,gro EL-sufC-hsaA三基因和gro EL-sufC双基因串联表达菌株的最大PA生成量分别为12.86 g/L(48 h)和12.75 g/L(48 h),比对照菌株pART2分别提高了31.93%和30.90%;在45 g/L底物CA和8%乙醇助溶体系中,gro EL-sufC-hsaA三基因和gro EL-sufC双基因串联表达菌株的最大PA生成量分别为41.96 g/L(72 h)和39.82 g/L(96 h),比对照菌株pART2(28.58 g/L,84 h)分别提高了46.82%和39.33%。上述结果表明,CA到PA的转化涉及到底物转运、酶活调控、胁迫耐受性等多个靶点,系统生物学和模块化工程思想是构建优良菌株的有效手段。利用pEX18Gm自杀载体,以upp为目标基因进行简单节杆菌同源重组敲除的初步探索。结果发现,在单交换时会发生非理性重组,利用该敲除系统无法在简单节杆菌中实现基因的敲除。通过生物信息学分析发现简单节杆菌存在NHEJ系统,通过线性化质粒再环化实验测定其修复效率约为77%。对三种不同来源的Cas9(化脓性链球菌Streptococcus pyogenes的SpCas9、基于该蛋白针对简单节杆菌进行密码子优化的As Cas9和针对哺乳动物进行密码子优化的MCas9)的密码子使用频率分析和蛋白表达验证,发现MCas9可在简单节杆菌表达。构建并利用组成型CRISPR/MCas9敲除载体对简单节杆菌ksd D5进行敲除,发现长出的转化子均为“escaper”。之后,分别构建了尼古丁诱导型表达载体和IPTG诱导型表达载体,以绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,简称GFP)作为报告基因,发现只有后者可在简单节杆菌中正常使用,且不存在泄露表达。基于组学数据和实时荧光定量PCR(qRT-PCR),以GFP为报告基因,获得了12个梯度活性的包含启动子的序列(强度范围为68-1282 RFU/OD)。该工作为后续简单节杆菌基因编辑系统的建立和遗传操作系统的完善提供了重要的基础数据和实验材料。
