关键词:
下一代工业生物技术
盐单胞菌
聚羟基脂肪酸酯
基因编辑
代谢工程
摘要:
聚羟基脂肪酸酯(PHA)是微生物在胞内合成的一类高分子聚酯材料,具有环境友好、生物相容性优良、结构多样和性能可调节等特点。PHA作为石油基塑料的一种优良替代品,引起了全球科研界和产业界的广泛关注。但是,传统的工业微生物生产PHA存在发酵过程易染菌、发酵流程复杂等问题,使其生产成本较高,这限制了PHA的大规模应用。为了解决这一问题,以极端微生物作为底盘细胞的“下一代工业生物技术(Next Generation Industrial Biotechnology,NGIB)”近年来应运而生。嗜盐微生物是一类需要较高浓度盐离子维持生长的极端微生物,具有在普通微生物无法生长的环境中快速生长的特性。NGIB基于嗜盐(碱)菌已成功开发了开放式无灭菌连续发酵工艺,用于低成本合成包括PHA在内的多种化学品。但是目前工业化嗜盐菌所需氯化钠浓度过高,这不仅增加了原料盐的成本,而且也提高了发酵废水的处理成本。因此,需要研究者开发更优的低盐高碱嗜盐菌底盘细胞,用于PHA等产物的合成。
课题组前期从内蒙古自治区盐碱湖中分离了一株编号为X339的嗜盐菌,初步发现它能在含较低氯化钠浓度的培养基中快速生长。本论文以嗜盐菌X339为研究对象,首先对该菌的种属进行认定,并初步研究了它的生理生化特性。该菌的16S rRNA序列与Halomonas nigrificans MBT G8648的16S rRNA序列同源性高达99.93%,因此将X339命名为Halomonas nigrificans X339。最适生长氯化钠浓度测试结果发现,X339能在1%至15%(w/v)的氯化钠含量的培养基中生长,最适生长氯化钠浓度为2%-7%(w/v)。海水中的盐离子浓度为3%(w/v),这赋予了X339利用海水作为发酵基质的能力,从而节约淡水资源。最适pH测试结果发现,X339能在pH 6.5至pH 11的培养基中生长,最适pH为8.5-9.0。同时还测试了菌株X339对27种常见的廉价可持续性碳源的利用能力,结果显示它能利用多达23种的碳源进行生长,包括葡萄糖、果糖、甘油、淀粉等常见碳源,以及木糖、阿拉伯糖、乙酸、丙酸、棕榈油等非粮碳源。
然后检测了X339合成PHA的能力。当以葡萄糖为碳源时,其合成PHA的种类为PHB,X339胞内合成的PHB颗粒的尺寸长度超过1μm,这在PHA天然合成菌中不多见,大尺寸PHA颗粒方便产物提取纯化。在最初的发酵实验中,X339利用30 g/L葡萄糖发酵48 h合成了2.4 g/L PHB,在发酵液中检测到了丙酮酸和α-酮戊二酸的产生,有机酸不仅分流了一定量的碳源,而且还导致pH降低,从而抑制了菌体生长和PHB合成。为解决上述问题,测试了MOPS缓冲剂对发酵的影响,结果显示40 g/L MOPS的添加,减少了有机酸的产生,同时将PHB产量提高到了6.63 g/L。根据优化的PHA发酵条件,我们检测了X339利用其他碳源合成PHB的能力。48 h发酵结果显示,X339能利用木糖、果糖、麦芽糖、乙酸、柠檬酸、淀粉合成产量分别为1.88、5.08、8.88、6.31、4.21、6.23 g/L PHB。然后,我们又检测了X339利用混合碳源合成PHB的能力,结果显示以20 g/L葡萄糖+10 g/L木糖作为混合碳源时,PHB产量为5.55 g/L,以20 g/L葡萄糖+10 g/L木糖+2 g/L乙酸作为混合碳源时,PHB产量为6.65 g/L,乙酸的添加提高了PHB产量约20%。葡萄糖、木糖、乙酸是木质纤维素水解液的主要组成成分,以木质纤维素水解液作为原料进行发酵生产避免了与人争粮,因此具有广阔的开发和应用潜力。我们利用小麦秸秆水解液为碳源测试了X339在不灭菌开放的发酵条件下的PHB产量,发酵72 h后可合成5.23 g/L PHB,这一产量在已报道的盐单胞菌利用纤维素水解液合成的PHB产量中处于较高水平。上述结果表明X339是一株鲁棒性强、具有优良特性的NGIB底盘细胞,尤其是发现该菌可利用纤维素水解液合成PHB。
为了加速X339菌株的代谢工程改造,构建了X339遗传操作系统,开发了该菌的基因编辑技术。首先测试了X339的抗生素敏感性,在测试的7种抗生素中,结果发现Tet、Cm、Gen、Neo对X339的最小抑菌浓度为10μg/m L、10μg/m L、70μg/m L、200μg/m L。选择质粒pSEVA341(Cm抗性)、p BBR1MCS5-RFP(Gen抗性)进行X339的转化方法测试,结果显示两种质粒都能通过接合转化或电转化方法被转入X339菌株,且稳定存在。X339编码了Ⅰ-E型CRISPR-Cas系统,将它的spacer与NCBI的病毒数据库进行比对并分析protospacer的邻近序列,推测该CRISPR-Cas系统