关键词:
柯萨奇B4型病毒
全长基因
感染性克隆
脂质体转染
反向遗传系统
摘要:
柯萨奇B组4型病毒(Coxsackievirus B4,CVB4)属于肠道病毒的B组分型,CVB4属于小核糖核酸病毒科(Picornavirus)肠道病毒属,为单股正链RNA病毒(+RNA),其在复制和翻译时直接以正链RNA为模板,合成病毒RNA,与蛋白质组装形成病毒颗粒,由于复制过程中并不经过DNA中间体,这就增加了对RNA病毒研究的难度。而随着反向遗传学技术的不断发展,通过在体外获得RNA病毒的cDNA并整合入载体,利用重组质粒转染的方法,能够得到携带有病毒全基因组且具有感染性的病毒粒子,实现了对RNA病毒全基因组在DNA水平上的研究。目的在我国,CVB4在手足口病重症患者中均有报道,可引起脑炎,具有严重的发病率和死亡率。目前缺乏安全有效的疫苗和药物,因此亟需开发具有抗肠道病毒的减毒活疫苗,反向遗传系统的构建为减毒活疫苗的研发提供了技术支持。本研究的整体研究目的包括:CVB4毒株原核及真核感染性克隆的构建;CVB4重组病毒的拯救及特性的验证。反向遗传系统的成功构建对进一步开展CVB4致病性、免疫特性等方面的分子机制研究及减毒活疫苗的研发提供了技术支持。方法本研究基于实验室建立的肠道病毒样本库,通过对分离鉴定的CVB4病毒进行全基因组及VP1片段的遗传发育分析,选取SDLW1/CHN/2013(登录号:MF179587)(LW1)为CVB4代表株。针对LW1株全长基因组序列,设计数对特异性引物,分7段扩增出全长c DNA,并在5’UTR区的上游引入了T7启动子序列和Not I酶切位点,在3’UTR下游引入了含26碱基的Poly(A)尾以及Sal I酶切位点。利用Overlap-PCR方法扩增获得了3段融合片段,即5’UTR-F1(1-3336bp)、F2(3337bp-6324bp)和F3-3’UTR(6325bp-7439bp),并将各融合c DNA片段分别依次克隆到p WSK29载体中。利用两端引入的NotI、SalI及内部自身酶切位点AlwNI、EcoRV顺次进行全长连接。基于构建的原核克隆质粒p WSK29-LW1,在CVB4全基因组5’UTR端通过PCR扩增的方法引入锤头状核酶(Ham Rz)及Not I酶切位点识别序列、pcDNA3.1(-)载体同源区,在3’UTR引入丁型肝炎核酶(Hdv Rz)序列及Bam H I酶切位点识别序列、pc DNA3.1(-)载体同源区,并通过Overlap-PCR(融合PCR)的方法将LW1基因组引入含有CMV启动子的pc DNA3.1(-)载体中,获得真核重组质粒pc DNA3.1-LW1,即CVB4流行株LW1的感染性克隆。使用脂质体转染的方法,将构建的pcDNA3.1-LW1感染性克隆加入Vero细胞中,进行CVB4病毒的拯救。在转染后24h,细胞开始出现皱缩、变圆、折光率增强的典型CPE表征。结果构建的原核克隆质粒经测序鉴定及基因组序列同源性比较表明,已成功获得含LW1株全长基因组的原核克隆质粒p WSK29-LW1,与野生型CVB4毒株基因组具有99.98%的亲源性。在原核克隆质粒的基础上构建的真核克隆质粒,通过测序分析,显示该重组质粒中CVB4基因组全长序列保持了与p WSK29-LW1重组质粒中CVB4基因组序列的100%亲源性。对被拯救的原代病毒继续在Vero细胞中进行稳定传代,在连续盲传3代的细胞上清中均测定有VP1片段的PCR特异性扩增,说明已成功拯救到一株CVB4重组病毒,经过测序鉴定,所得毒株序列与预期的基因组序列完全一致。结论本研究通过PCR高保真酶,及融合PCR桥连的方式成功构建了含CVB4-LW1株全长基因组的原核克隆质粒p WSK29-LW1;且在此基础上,构建了真核克隆质粒,运用脂质体转染法成功拯救出重组病毒,说明本研究已成功构建了CVB4的反向遗传系统。