关键词:
猪传染性胃肠炎病毒
反向遗传操作系统
重组病毒
附属蛋白3
非结构蛋白
摘要:
猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)属于尼多病毒目冠状病毒科α冠状病毒属家族成员,其主要感染新生仔猪,造成仔猪腹泻、呕吐、脱水甚至死亡。临床上经常与猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea,PEDV)和猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PRo V)等其他腹泻相关病毒混合感染,给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。冠状病毒除了编码结构蛋白和参与病毒基因组转录、复制的非结构蛋白外,还编码了一系列特有的附属蛋白。目前的研究表明大部分附属蛋白对于病毒的复制是非必需的,但附属蛋白可能影响病毒的致病性。TGEV已经被鉴定编码2种附属蛋白,即ORF3和ORF7。现有研究表明ORF3参与了宿主天然免疫反应的调节,但其对病毒复制及致病过程中发挥的作用尚不明确。反向遗传操作系统可为病毒蛋白功能研究、毒力因子鉴定、新型疫苗研发和抗病毒药物的筛选提供物质基础与技术支持。基于此,本研究通过建立TGEV TH-98株的反向遗传操作系统,探索TGEV的ORF3蛋白在病毒复制中的作用,确定ORF3在病毒粒子中的定位及其是否能够引起机体产生免疫应答反应,为利用以TGEV为骨架进行该病毒的基础研究以及构建重组病毒疫苗奠定基础。主要研究结果如下:1.成功建立TGEV TH-98株的反向遗传操作系统将TGEV TH-98株全长基因组分为6个(A-F)具有同源臂的片段,并将片段分段克隆,随后按照A-F-D-E-B-C的构建顺序获取TGEV全长cDNA克隆,随后将TGEV全长cDNA克隆转染至ST细胞拯救TGEV。将拯救病毒rTGEV与TGEV亲本毒株进行对比分析,发现两者的全基因组序列除了分子标记外完全相同,在ST细胞上可产生相同的细胞病变,Western Blot、间接免疫荧光试验可检测到TGEV N蛋白的表达。对拯救病毒rTGEV的生物学特性进行研究,发现其与TGEV亲本毒在ST细胞上产生的蚀斑大小相似,并且在ST细胞和IPEC-J2细胞中生长动力学相似,电镜下观察到经典冠状病毒特征,以上结果表明我们成功建立了TGEV反向遗传操作系统,为后续研究奠定了物质基础。2.构建重组病毒rTH-98-Δ3-COE-HA并揭示了TGEV ORF3在病毒复制中的作用为了研究ORF3的缺失是否影响病毒的复制,我们将TGEV TH-98基因组中ORF3基因替换成PEDV COE基因并于其C端引入HA标签,构建重组病毒rTH-98-Δ3-COE-HA。重组病毒rTH-98-Δ3-COE-HA的生物学特性分析表明,重组病毒基因组中的外源基因可以稳定传代和有效表达,表明重组病毒构建成功;TGEV缺失ORF3后在体外仍然可以复制,ORF3对TGEV的复制不是必需的。重组病毒rTH-98-Δ3-COE-HA感染ST细胞后产生的蚀斑大小、病毒滴度和生长曲线等生物学特性与其亲本毒株相似,但重组病毒rTH-98-Δ3-COE-HA的复制效率明显降低,表明TGEV ORF3可能在促进病毒复制中起关键作用。3.探索了ORF3蛋白在TGEV亲本病毒粒子中的定位为了进一步分析TGEV ORF3是否存在于成熟的病毒粒子上,将纯化的重组病毒rTH-98-Δ3-COE-HA病毒粒子进行Western Blot分析,在纯化的病毒粒子中未能检测到外源蛋白COE-HA,初步证明ORF3不存在于成熟的病毒粒子中。随后将纯化的重组病毒皮下免疫小鼠,采集免疫后小鼠血清,可以检测到小鼠抗TGEV N蛋白的特异性Ig G,却无法检测小鼠抗COE特异性Ig G,进一步证明ORF3不存在于成熟病毒粒子中,说明ORF3为非结构蛋白。4.探究了重组病毒诱导IPEC-J2细胞表达炎症因子的水平为了研究重组病毒在IPEC-J2中细胞炎症因子表达水平,将重组病毒rTH-98-Δ3-COE-HA感染IPEC-J2细胞,利用RT-q PCR检测细胞样品中炎症因子表达水平,结果显示在IPEC-J2细胞中重组病毒rTH-98-Δ3-COE-HA可诱导炎症细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8的表达,但表达水平显著低于由亲本毒TH-98及亲本拯救毒rTH-98,该结果表明TGEV ORF3可能在诱导宿主细胞免疫反应中起关键作用。5.重组病毒表达外源蛋白在小鼠体内的免疫原性为了确定重组病毒rTH-98-Δ3-COE-HA中表达外源蛋白是否具有免疫原性,将重组病毒rTH-98-Δ3-COE-HA细胞培养物皮下免疫小鼠,采集免疫后小鼠血清,以TGEV N蛋白与PEDV COE蛋白为包被抗原,利用间接ELISA检测小鼠血清中特异性Ig G的表达水平。结果显示,小鼠体内抗TGEV特异性Ig G与抗PEDV COE特异性Ig G水