关键词:
复制起始位点
质粒拷贝数
生物反应器
摘要:
为通过优化质粒pUC57的复制起始位点,提高其在宿主菌中的拷贝数,利用随机突变PCR技术对质粒pUC57的复制起始位点进行了定向突变,发现突变后的质粒pUC57-Mu-Ori-kana(Mu代表突变)显示更高的拷贝数。采用分子克隆技术中的同源重组方法,将pUC57-Mu-Ori-kana作为载体,连接新的目的基因片段。通过使用商品化感受态细胞DH10B对质粒进行转化,发现质粒产量显著提升。经过传代稳定性验证,进一步在生物反应器中使用改良的MLB培养基对新质粒菌进行放大培养。最终,从发酵罐中取得的样本显示,质粒的终产量可达到600 mg/L。突变后的复制起始位点显著提升了质粒的拷贝数,挑取阳性单克隆测序,最终获得了两个不同的质粒目的片段序列。通过同源重组技术,将突变后的片段和未突变的片段与原始载体连接起来,对比发现,在相同的转化情况和提取工艺条件下,pUC57-Mu-Ori-kana提取量是原始pUC57-kana的1.5倍。此外,DH10B-pUC57-Mu-Ori-kana在生物反应器放大培养后,也得到了令人满意的产量。