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关键词： Vero细胞   反向遗传重配   生物反应器   Capto Q   流感灭活疫苗  

摘要： 流感病毒通过抗原重配或漂移产生新的病毒,每年在全球引起较高的发病率和死亡率。疫苗是预防流感的主要有效手段。目前上市的流感疫苗主要有灭活苗、减毒活疫苗和重组HA疫苗,基本上都以鸡胚作为生产基质。采用鸡胚生产疫苗的缺点:存在外源因子污染的风险;鸡胚供应周期长,尤其是当大流行流感来袭时有可能因禽流感的流行,会影响鸡胚供应。鉴于此,WHO鼓励开展以哺乳动物细胞代替鸡胚作为流感疫苗生产基质的研究。Vero细胞是WHO批准生产人用疫苗的传代细胞系,能够利用生物反应器进行大规模培养,已广泛用于疫苗生产。然而,Vero细胞对流感病毒不敏感,多数流感毒株连续传代效价降为0。流感病毒的高变异性,WHO每年都要根据各监测点提供的信息推测下一年度的流行株。一般地,流行株在鸡胚和Vero细胞产毒量都较低,推选出来的毒株需要与高产母本株遗传重配制备新的疫苗生产用毒株,在流感高发季节来临前必须完成疫苗种子批制备、疫苗生产及其检定,时间紧张。因此,稳定而快速地制备毒种显得尤其重要。本研究以本实验室前期选育出的Vero细胞适应A/kunming/1/2005va作为母本株,比较点突变法和一步克隆技术的效果,并对不同转染方法拯救流感病毒进行研究,建立了以一步克隆法及Effectene Transfection Reagent转染制备Vero细胞流感疫苗候选株的反向遗传学技术。并依此法,以Vero细胞适应株A/kunming/1/2005va的六个核心片段PB2、PB1、PA、NP、NS、M与流行株A/上海嘉定/SWL1970/2015（H1N1）的表面抗原HA和NA组合,拯救出了新的疫苗候选株H1N1嘉定Va,具有在Vero细胞高产的表型。鉴于Vero细胞缺乏将流感病毒HA0裂解成HA1的酶,只有在培养液中添加胰酶,病毒才能组装成熟。有血清培养细胞时残留的血清会导致胰酶失活。无血清培养细胞是目前疫苗生产的研究热点,可克服血清成分对病毒培养的干扰,还可消除培养时潜在污染源并利于分离纯化。本研究通过优化生物反应器培养方法和发酵工艺参数,建立了生物反应器,无血清培养流感病毒的生产工艺。并对病毒收获液进行过滤澄清、超滤浓缩、凝胶过滤、离子交换层析和甲醛灭活等后处理工艺研究。选用不同凝胶及离子介质进行纯化工艺比较研究,最终确定使用Sepharose 4 Fast Flow和CaptoQ时病毒回收率高,杂蛋白去除率在99%以上,疫苗蛋白含量不高于10μg/剂、DNA残余量≤100pg/剂,以上指标均达到现行中国药典及WHO标准。综上所述,本课题建立了反向遗传学快速稳定制备Vero细胞流感疫苗候选株,并以生物反应器微载体无血清培养Vero细胞和流感病毒,首次将Capto Q用于Vero细胞流感病毒纯化,病毒回收率高,制备的流感灭活疫苗安全有效,将促进全球流感疫苗生产技术的升级换代。

关键词： 生物膜(污水处理)  

ISBN: (纸本)9787030512352

摘要： 本书主要介绍水处理MBR的技术原理与应用。首先介绍MBR的基础知识，包括MBR的技术特征，膜污染概念、特征、分类及其控制策略以及MBR的设计与运行要点。然后介绍MBR的膜组件以及处理城市污水、微量有机污染物、工业废水、受污染水源水以及高浓度污水污泥的特性。最后介绍MBR的工程应用案例。

关键词： H5、H1亚型多表位流感重组腺病毒   生物反应器   纯化   免疫  

摘要： 禽流感病毒(AIV)是一种人畜共患传染病的病原体,影响着全球人类的所有经济和健康问题。大多数禽流感病毒亚型很少甚至不能引起水禽患病,但家禽中爆发禽流感与死亡率高密切相关。虽然禽流感病毒很少传播给人类,该病毒经过突变或重组后具有引发危及生命的感染能力。新的流感病毒株的不断出现,使预测其表现、传播、毒力或人与人之间的传播潜力颇具挑战性。由于很难预测哪些病毒株或什么位置突变将引起下一次流感大流行,所以很难提前做好准备。疫苗接种能够起到有效预防作用,因此研究新型疫苗尤为重要。流感重组腺病毒疫苗能够刺激机体产生较高水平的体液免疫和细胞免疫,且重组腺病毒载体具有稳定性好、安全性高和宿主范围广等优点,近年来受到人们广泛的关注,具有良好的发展前景。生物反应器微载体培养技术由于其培养表面积大、易于对细胞进行实时检测和控制,在疫苗生产领域被广泛应用。阴离子交换层析具有灵敏度高、选择性好、分离速度快等优点,分子筛层析具有操作条件温和、对于高分子物质分离效果好等优点,目前这两种层析纯化方法较为常用。本实验室构建了以季节性流感H5亚型和大流行性流感H1亚型HA(HA1)基因为主,以禽流感H1、H7和H9亚型HA抗原Th表位及M1表位为表达盒的重组腺病毒疫苗。通过7L生物反应器微载体培养系统对H5、H1亚型多表位流感重组腺病毒进行大量培养,将发酵产物处理后,采用阴离子交换层析和分子筛层析进行纯化,鉴定正确后,进行安全性评价试验。生物反应器培养HEK-293细胞,经过多次优化试验,确定培养参数为:温度:37℃、pH:6.9、搅拌速率:30r/min、溶氧:50%、CO2浓度:5%。培养24h后,85%以上细胞贴壁微载体,24-36h细胞增长率较高,48h更换培养液,84h细胞总数增长了4倍,之后细胞生长呈现下降趋势。利用生物反应器微载体培养技术大量扩增H5、H1亚型多表位流感重组腺病毒,当HEK-293细胞长满微载体表面80-90%时,以5MOI接种H5、H1亚型多表位流感重组腺病毒,48h后收取病毒液,处理后测得病毒滴度为1.0×1010TCID50/mL。利用生物反应器培养的H5、H1亚型多表位流感重组腺病毒的病毒滴度为1.0×1010TCID50/mL,经过阴离子交换层析纯化和分子筛层析纯化后,病毒滴度为1.0×1010TCID50/mL,两步纯化的回收率分别为30.8%和89.3%,总回收率为27.5%,对纯化后的样品进行PCR鉴定,结果表明基因未丢失。检测260nm和280nm处吸光值OD260/OD280=1.25,符合纯度要求。将发酵和纯化后的重组腺病毒进行小鼠免疫实验研究和安全性评价。研究结果表明,经过两步纯化后的H5、H1亚型多表位流感重组腺病毒疫苗能够刺激机小鼠产生特异性抗体及细胞免疫应答,且两步纯化疫苗组的细胞因子水平高于其他疫苗组。安全性评价试验结果表明,两步纯化的H5、H1亚型多表位流感重组腺病毒疫苗的安全性良好。总之,本实验初步证明了生物反应器微载体培养系统扩增的H5、H1亚型多表位流感重组腺病毒疫苗,经阴离子交换层析和分子筛层析纯化后,能使小鼠产生体液免疫和细胞免疫,具有一定的保护性作用。

关键词： 反应器   丛生芽   有效物质   诱导子   抗氧化活性  

摘要： 金线莲是具有极高药用价值的珍稀植物,但其野生资源和人工栽培的产量难以满足市场需求。为了提供金线莲丛生芽作为产品生产的另一种原材料,本研究利用生物反应器培养金线莲丛生芽,探究了影响丛生芽生长和有效物质积累的因素,同时使用诱导子促进丛生芽中有效物质的生产量。为了筛选丛生芽培养的适宜培养基,用均匀设计法对MS培养基浓度和不同植物生长调节剂浓度的影响进行了研究,结果表明3/4MS培养基中加入2.0 mg·L-1 BA,0.2 mg·L-1KT和0.5 mg.L-1 NAA的组合最利于丛生芽的生长和多糖、金线莲苷、总酚及黄酮四种有效物质的积累;用均匀设计法对培养基中蔗糖、磷和氮浓度的效果进行调查的结果,蔗糖为35 g·L-1,3/4MS培养基中磷浓度为0.93 mM和氮浓度为45 mM的组合最佳。进一步对硝态氮和铵态氮浓度比的影响进行了研究,发现将3/4MS培养基中的硝态氮和铵态氮调节为30 mM和15 mM为宜。丛生芽在球体下部设支持网的反应器中生长最佳。丛生芽在反应器培养时,0～20 d为生长停滞期,20～30 d为指数生长期,30～40 d为平稳期,丛生芽在培养第30 d时四种有效物质的积累量最多。对丛生芽接种量、通气量及光照强度进行探究的结果,四种有效物质生产量在接种量为12.5 g·L-1和通气量为500 ***-1最多;不同的有效物质对光照强度的要求不同,2400 Lux下金线莲苷和多糖积累的最高和1600 Lux下总酚和黄酮的积累最高。利用水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和酵母提取物（YE）作为诱导子对其适宜处理时间和浓度进行了调查,当用475μM的SA处理丛生芽12 d时,最利于金线莲苷的生产;用525 μM的MeJA处理16 d时,利于黄酮的生产;SA、MeJA和YE对多糖和总酚生产均有同样的促进作用。对丛生芽提取物的抗氧化活性进行测定的结果,发现丛生芽提取物对DPPH自由基清除力呈剂量依赖性,具有一定的抗氧化能力。

关键词： 小球藻   气液分离   气体流速   CO2浓度   光照强度  

摘要： 微藻是一种优质的生物柴油原料,相比传统的油料作物,它具有光合效率和油脂含量高、培养周期短、不占用耕地等优点。目前,微藻的规模化生产主要采取悬浮式培养,但是悬浮培养具有生物密度低、采收困难等不足。而微藻的生物膜固定化培养则有效解决了上述问题。由此,本课题设计了一种气液分离的膜式光生物反应器,利用膜材料将微藻培养过程中所需要的液体培养基和气体分离开,降低微藻培养过程中CO2的扰动作用,以提高微藻的吸附能力和生物量密度。并利用所设计的气液分离的膜式光生物反应器开展了气体流速、CO2浓度以及光照强度对微藻生物膜生长与代谢特性的影响研究,并获得优化的微藻培养条件。课题首先开展了不同气体流速对微藻生物膜生长与代谢特性的影响研究。研究发现,随着气体流速的增加,微藻生物膜生物量、叶绿素a以及叶绿素b的含量呈先增加后减少的趋势。在气体流速为40 ml/min获得微藻生物膜最大生物量,为28.4 g/m2,在气体流速为60 ml/min获得最高叶绿素a和叶绿素b的含量,分别为13.91 mg/g和9.15 mg/g。微藻细胞中淀粉含量随气体流速变化较大,呈先减少后增加的趋势。而微藻细胞内类胡萝卜素、蛋白质以及油脂的含量随气体流速变化不大,分别占细胞干重的0.00178-0.0028%、25.89-29.82%和12.96-15.8%。另外,当气体流速为20 ml/min时,CO2的除去率最高,为62.4%。通过开展CO2浓度对微藻生物膜生长与代谢特性的研究发现,微藻生物膜的生物量、蛋白质以及油脂含量都呈先增加后减少的趋势,并都在3%的CO2浓度下达到最大,其中生物膜生物量为29.02 g/m2,蛋白质和油脂含量分别占细胞干重的27.85%和15.8%。当CO2浓度≥1%时,叶绿素a的含量明显高于空气组,为22.11-24.56 mg/g,而叶绿素b的含量随CO2浓度的增加有明显的增加趋势,并在10%的CO2浓度条件下达到最高,为16.25 mg/g,类胡萝卜素含量变化不显著。不同CO2浓度下淀粉含量呈先减少后增加趋势,在3%的CO2浓度条件下含量最低,为20.49%。另外CO2浓度为3%时除去率最高为52.5%。通过开展光照强度对微藻生物膜生长与代谢特性的研究发现,微藻生物膜的生物量、类胡萝卜素以及油脂含量随着光照强度的增加呈明显的上升趋势,且都在光强为230μmol·m-2·s-1时达到最高。其中生物膜生物量为38.52 g/m2,类胡萝卜素含量为3.6 mg/g,油脂含量占细胞干重的31%。细胞内叶绿素a、叶绿素b以及淀粉的含量随光照强度呈先增加后减少趋势,在光强为20μmol·m-2·s-1获得最大叶绿素a和叶绿素b的含量,分别为24.81 mg/g和15.08 mg/g,光强为30μmol·m-2·s-1时淀粉含量最高,为39%。而不同光照强度下蛋白质含量差异较小。通过测定小球藻的油脂组分,其中主要的脂肪酸组成为C16:0、C16:1、C18:0、C18:1、C18:2和C18:3,其中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸分别占总油脂含量的30%和60%。表明该藻是生产生物柴油的良好原料。同时实验结果表明,微藻在培养过程中合理的补充碳源和光照对微藻的生长和产油至关重要,所以在微藻的培养过程中应合理的利用碳源和光能。

关键词： 城市生活垃圾   甲烷气   发酵   微生物  

摘要： 城市生活垃圾（Municipal solid waste,简称MSW）是在城市日常生活及为城市生活提供服务的活动中产生的固体废弃物,是城市环境的主要污染物之一。垃圾在填埋过程中会产生大量的填埋气,其中占40～60%的甲烷既是重要温室气体又是一种重要的能源资源。本文用实验室模拟的方法研究了添加不同微生物菌剂以及发酵参数（常温、中温）对厌氧发酵气体的影响,分析了气液特性和微生物群落的关系,以期揭示不同因素影响的微生物学机理。取得的主要结果和结论如下:1.垃圾样品中微生物的浓度和种类分布受温度影响较大,发酵初期（常温）种类丰富浓度较低,产气组分不含甲烷,中温阶段（35℃）微生物种类减少浓度增加,甲烷含量逐渐增高,可见中温35℃更利于发酵产甲烷。2.在OTU表中对外加特征菌种进行核查的结果表明,只有蛋白组添加的Proteiniphilum acetatigenes（产乙酸噬蛋白质菌）和Bacteroides thetaiotaomicron（多形拟杆菌）产生了定殖,强化了发酵体系内有机物,特别是蛋白质的分解,提高了累积产气量和产气效率。蛋白组平均产气量为1353.70ml,高于其他组19.27%7.59%;单位质量垃圾累积产气量蛋白组最高为966.90ml/Kg,高于其他组19.12%7.58%。3.发酵初期产酸菌大量增殖造成沼液VFA、TOC、COD值迅速上升,累积有机酸和小分子有机物,为甲烷化做准备。进入产气高峰期后Methanobacterium（甲烷杆菌属）占比大幅提高,蛋白组甲烷杆菌属占比高达10.16%,远高于其他组;而蛋白组甲烷体积百分比达到43.28%,脂肪、纤维、空白组三组均在22%左右,全菌种组则最低为19.98%。4.本实验中沼液的VFA、TOC、COD值均处于较高水平,而TOC和COD最高下降百分比均处于较低水平,TOC不超过35%,COD不超过28%。由于系统密闭,沼液大量产生后损失较少,而有机物浓度较高,后续处理可用作液体肥料。

关键词： 酸性染料   正渗透膜   厌氧生物反应器   特征污染物   膜污染  

摘要： 正渗透技术作为新型膜分离技术,近年来在环境工程领域也备受关注。厌氧生物反应器结合正渗透技术的工艺,由于其高效的分离效率和简单的流程也成为研究热点。本试验就是结合两种技术的优势-利用厌氧过程对染料的高效降解与脱色及正渗透的高效分离,针对酸性染料废水处理进行研究。试验分别从染料降解与脱色机理入手,对膜污染进行表征,评价正渗透厌氧膜反应器的性能与效率,为该工艺在工业应用的可行性作探索性的研究。实验内容主要分两个部分,首先是对两种酸性染料分别为Lanaset兰纳洒脱RED ***和Lanaset兰纳洒脱Yellow 4GN进行厌氧生物反应器的处理,通过测定COD,色度以及降解产物分析它们的降解机理。其次,分析正渗透膜在厌氧生物反应器中的性能测评,包括膜污染分析、通量衰减分析、盐反渗影响及特征污染物的渗透过程。对两种酸性染料降解机理探索的过程中,研究发现这两种染料通过厌氧生物降解五天内的COD去除率在不断的增加Lanaset兰纳洒脱RED ***的COD去除率从1d的54.76%增加到89.53%,Lanaset兰纳洒脱Yellow 4GN的COD去除率从1d的62.62%增加到81.62%。但两种染料的色度的去除率却在不断的减小。Lanaset兰纳洒脱RED ***的色度去除率从1d的44.63%到5d降到了17.94%,Lanaset兰纳洒脱Yellow 4GN的色度去除率从1d的59.31%降到12.72%。利用GC-MS对两种染料的降解产物的分析中发现,染料的产物种类随时间的增加也在增加。在正渗透膜生物反应器处理两种染料的60d过程中发现,无论是对Lanaset兰纳洒脱RED ***还是对Lanaset兰纳洒脱Yellow 4GN。反应器中的电导率都是随时间的增加而增加的,在Lanaset兰纳洒脱RED ***的反应中,出水电导率从开始的4673μs/cm增加到9772μs/cm,在Lanaset兰纳洒脱Yellow 4GN反应中,出水电导率从4902μs/cm到7503μs/cm。它们COD降解率在60d内表现出来的都是随着时间有下降的趋势。Lanaset兰纳洒脱Yellow 4GN和Lanaset兰纳洒脱RED ***分别下降的百分率是5.01%、7.02%。在FO-An MBR工艺中对两种染料在60d的脱色效果还是相对较高的。FO对它们两的脱色效果都非常的高分别是98%和99%左右。但也是随时间的变化有下降的趋势。对于FO-An MBR工艺对两种染料在厌氧反应器中产生的苯胺类的化合物在FO模式的截留下,对其的截留效果都不是很高。Lanaset兰纳洒脱RED ***比Lanaset兰纳洒脱Yellow 4GN截留率分别是40%和50%左右。FO-An MBR的长期运行看,膜通量在60天的通量变化趋势都是随时间逐渐下降的。但FO-An MBR处理RED ***染料废水时的通量衰减率比Yellow 4GN要快。两者的通量在60天的衰减率分别是79.44%和77.79%。通过EPS和SMP以及膜的表面形貌和SEM图分析膜污染的情况,可以看出两个反应器由于进水的不同也会导致污泥的菌类种群的不同,进而会影响膜污染程度也不同。总之,从实验中得出,厌氧生物反应器降解这两种酸性染料并不能使染料完全降解,而用正渗透处理这两种酸性染料,对COD,色度去除都很高,但对苯胺类化合物的截留相对较低。总体来说用正渗透处理酸性染料废水还是相对可行的。但是在此过程中膜污染相对严重,要想达到很好的处理效果则要对膜经常进行清洗以及更换。

关键词： 厌氧膜生物反应器   快速启动   膜污染控制   含酚废水  

摘要： 酚类及含氮杂环类物质属于典型的有毒、难降解有机物,其来源包括煤制气、炼油、焦化和制药等废水。由于酚类及含氮杂环类物质的毒性较强,对人类健康与生态环境安全造成严重的威胁,因此寻求一种经济且高效的处理方法十分必要。活性污泥法仅适用于低浓度含酚废水的处理,在高浓度苯酚条件下会受到严重抑制。普通厌氧生物处理具有经济和节能的优点,但是存在反应器启动困难、污泥流失等问题。本论文采用厌氧陶瓷膜生物反应器处理含酚废水,对反应器的启动、膜污染控制和高浓度苯酚耐受特性及作用机制进行系统和深入的研究。首先,以城市污水厂剩余活性污泥作为接种污泥,在进水苯酚和喹啉浓度分别为500 mg/L和50 mg/L条件下,稳定运行30天后厌氧陶瓷膜生物反应器对苯酚和喹啉的去除率均达到99%,成功实现了反应器的快速启动。通过对比研究悬浮污泥与泥饼层的污泥特性,发现泥饼层比悬浮污泥有更高的产甲烷活性、苯酚降解活性和喹啉降解活性;菌群结构分析表明泥饼层具有比悬浮污泥更高的菌群丰度;通过评估公式计算了膜生物反应器中泥饼层对污染物去除贡献,脱落的泥饼层在厌氧膜生物反应器的快速启动中所起的促进作用被严重低估。其次,研究了颗粒活性炭和聚合氯化铝的投加对膜生物反应器的膜污染控制效果及作用机制。结果表明,在厌氧陶瓷膜生物反应器中投加颗粒活性炭能在短时间延缓膜污染速率,但是对长期运行的反应器则连续投加聚合氯化铝效果维持时间更长、效果更好。当聚合氯化铝的投加浓度为200 mg/L时,污泥混合液中SMP和EPS的蛋白/多糖比例升高,悬浮污泥的疏水性增强,其过滤性能得以提升,同时泥饼层结构较为疏松。最后,研究了厌氧陶瓷膜生物反应器对高浓度苯酚的耐受特性和作用机制。结果表明,在进水苯酚浓度为1～3 g/L时,苯酚和喹啉的去除率分别达到97.6%和95.6%以上。当进水苯酚浓度达到4和5 g/L时,厌氧陶瓷膜生物反应器成功耐受了高负荷苯酚的进水条件,其酚处理负荷高达0.19 g/(gVSS·d),苯酚和喹啉的去除率分别为97.6%和95.6%左右。菌群结构分析表明,随着进水苯酚浓度由1 g/L逐步增加至5 g/L,降解高浓度苯酚的菌属由Aminicenantes(26.09%)、Proteobacteria(21.5%)、Chloroflexi(13.38%)、Firmicutes(13.26%)转变为Proteobacteria(50.51%)、Bacteroidetes(14.25%)、Chloroflexi(8.67%)、Thermotogae(8.02%)。产甲烷菌由Methanothrix(41.54%)、Methanolinea(29.39%)、Methanospirillum(11.86%)转变为Methanolinea(45.87%)、Methanothrix(37.94%)、Methanosphaerula(6.54%)。

关键词： 膜生物反应器   污水处理   应用  

摘要： 针对污水处理领域的新技术——膜生物反应器，首先对其现状与分类进行分析，提出现阶段几种常见膜生物反应器类型，在此基础上围绕其优劣势，深入探讨了在污水回用和工业废水处理中的应用，以此为膜生物反应器的大面积普及提供可靠依据。

关键词： MBR   膜污染   群体效应   泥饼层  

摘要： 膜生物反应器(MembraneBio-Reactor)是一种由膜分离单元与生物处理单元相结合的新型水处理技术.膜污染是指混合液中的微粒及溶质大分子与膜存在着物理、化学或生物作用而在膜表面或膜孔内部沉积,造成膜孔变小或堵塞,进而在膜面形成泥饼层,使得膜通量减小和TMP增加的现象.膜污染影响因素有:膜性质,操作条件,混合液性质.膜污染过程大致分三阶段:前一二阶段属于物理性可逆污染,三阶段属于生物不可逆污染.而膜污染最大的表征因素即膜堵塞后形成的泥饼层.