关键词:
绿豆环氧水解酶
对映归一性水解
位置选择性
分子改造
固定化
生物反应器
(R)-硝苯洛尔
摘要:
以苯乙烯类氧化物衍生得到的手性邻位二醇是合成β-受体阻断剂药物的关键中间体,这类药物在治疗心血管疾病中发挥着很好的疗效,因此研究手性邻位二醇的合成具有非常广阔的医药研究价值。以环氧水解酶为工具,从外消旋的环氧化物出发合成手性邻位二醇,反应过程中无需金属离子和辅酶参与,且来源广泛,因此一直吸引着学者们的关注。但是大多数环氧水解酶在水解环氧化物时,都会面临最大理论得率50%的限制。本实验室前期获得的绿豆环氧水解酶2(VrEH2),能够对映归一性水解外消旋的对硝基苯乙烯氧化物(p-Nitrostyrene Oxide,pNSO),突破了动力学拆分水解的得率限制(≤50%yield),且生成以单一构型为主的(R)-对硝基苯基乙二醇(p-Nitrophenyl Glycol,pNPG)。但由于天然酶对(S)-底物的位置选择率rS(αS/βS)仅为7.3,造成产物(R)-pNPG的光学纯度并不完美(~84%ee),且对其他苯乙烯类氧化物的归一性程度更差。本课题通过解析酶的晶体结构,在结构信息指导下对酶的活性中心进行局部精准改造,以提高酶催化环氧水解反应的位置选择性,从而实现更加完美的对映归一性水解;并在此基础上拓展其底物谱适用范围,提升该酶在合成洛尔类药物前体中的应用潜力。本论文首先利用X-射线衍射技术解析了 VrEH2酶的晶体结构。通过对基因表达载体起始编码位置的优化,去除了蛋白N端的冗余序列,降低了蛋白末端的灵活性,促进了晶体的有序堆积,显著提高了晶体的衍射分辨率(3.20 (?)→1.39 (?)),并解析了 VrEH2的晶体结构(PDB:5XM6)。结构上VrEH2属于典型的α/β-水解酶家族,具有灵活的帽子结构域和狭长的底物通道,其活性位点由催化三联体(Asp101-Asp262-His297)和氧洞残基(Tyr150-Tyr232)组成。我们利用分子对接手段模拟了酶与S构型底物的结合构象,并通过分析催化残基与底物环氧基团间的相互作用,初步探究了其位置选择性的结构基础。通过酶与(S)-pNSO结合构象的分析,我们首先锁定了底物结合周围的4个非催化氨基酸残基(Phe33、Ile176、Phe196和Met263)。为了考察所选位点对VrEH2位置选择性的影响,我们设计简并密码子表(Val-Asn-Phe-Trp)对候选氨基酸残基进行了定点突变,构建了小巧型突变体库。其中突变体M263N可专一性地进攻(S)-pNSO环氧基团上的Cα,其位置选择率rS值(=αS/βS=99.0)相比于母本(rS=7.3)提高了 14倍,同时催化效率(kcat/Km)提升了近22倍;而突变体M263W的位置偏好性发生了翻转,rS值仅为0.1,催化效率(kcat/Km)也下降了近19倍,表明Met263位点的突变对(S)-pNSO的位置选择性和催化活性都具有强调控作用。为了探究位置选择性提高的原因,我们解析了突变体M263N(PDB:5Y6Y,分辨率1.50 (?))及其与(S)-pNSO复合物的晶体结构(PDB:5YB5,分辨率1.90(?)),发现Asn263酰胺基团的氮原子可与(S)-pNSO硝基上的两个氧原子形成氢键相互作用,微调了底物的结合构象,使得催化残基Asp101与环氧基团上Cα(3.2 (?))和Cβ(4.4 (?))间的距离差异(dCα2/dCβ2=0.53)更加明显,酶分子更易于进攻(S)-环氧底物Cα位,提高了位置选择性。由于酶突变体M263N在提高对(S)-pNSO位置选择性的同时,保留了对(R)-pNSO的优异位置选择性(rR=βR/αR=99.0),使得酶催化水解rac-pNSO的对映归一性程度近乎完美(99%conv.,98%ee)。随后,通过反应条件的优化,我们利用突变体M263N进行了制备反应,最终产物(R)-pNPG的分离得率为92%,ee值高达98%。在263位关键位点的普适性研究中,我们发现该热点残基对于其他环氧水解酶(PvEH1,GmEH)催化的位置选择性同样具有正调控作用,为此类环氧水解酶的对映归一性改造提供了有益的启示和参考。在此基础上,我们针对热点残基Met263进行了半饱和突变,从侧链基团的极性和大小角度考虑,构建了VrEH2的小巧型突变体库(Ala-Val-Cys-Ser-Asn-Gln)。通过测定突变体对苯乙烯类氧化物(1a-17a)的对映归一性水解性能,发现突变体M263V催化芳环对位取代的苯乙烯类氧化物(1a-6a)的对映归一性程度均有提高;而突变体M263Q催化间位取代的苯乙烯类氧化物(8a-17a)的对映归一性提升程度较为明显,产物的ee值由原来的不足20%提高至90%以上。我们分别测定了突变体对不同构型底物(1a,3a,11a)的位置选择率,说明Met263的突变对于其他苯乙烯类氧化物的位