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关键词： 生物制药   振荡式生物反应器   流场特性   剪切特性   混合性能   溶氧性能  

摘要： 生物制药通过细胞的体外培养快速获取医药蛋白，是21世纪具有广阔应用前景的产业，而为细胞体外生长提供生存环境的生物反应器，则是生物制药过程中关键的设备。动物细胞没有细胞壁，对于外界的环境变化非常敏感，所以对生物反应器流场环境的要求相当高，振荡式生物反应器作为新兴的动物细胞培养设备，有着高溶氧、低剪切等优势，相比其他生物反应器更加具有发展潜力。　　目前人们对圆形振荡式生物反应器研究比较多，但这种反应器与传统的搅拌式反应器相比，其混合和传质略差。为了在保持低剪切特性的同时，提升混合和溶氧性能，本文提出了非圆形振荡式生物反应器结构，并通过模拟仿真分析其流场特性，确定了能够满足培养要求的较优结构，然后继续分析了转速、工作体积对非圆形振荡式生物反应器内流场特性的影响，通过与圆形结构对比得出各自的优缺点。论文的主要研究工作和成果如下：　　（1）建立了振荡式生物反应器的气液两相流模型，采用VOF（Volume of Fluid）追踪反应器内流体的气液界面，液体的贴壁圆周运动采用RNG k-ε湍流模型模拟。通过数值模拟分析了圆形振荡式生物反应器的流动形态，并进行了圆形振荡式生物反应器流动特性实验，比较了圆形振荡式生物反应器流动形态的数值模拟和实验结果，发现在一个流动周期内不同时间节点上，数值模拟得到的液面高度和形状和实验中记录的结果基本吻合，验证了本文建立的反应器数值模型的可靠性。　　（2）通过数值模拟比较了圆形和非圆形（方形和椭圆形）振荡式生物反应器的流动特性，发现非圆形振荡式生物反应器内流体振荡更加激烈，其在湍流、溶氧、剪切特性上流场参数均明显大于圆形反应器，即非圆形反应器的混合和传氧能力显著优于圆形反应器。同时，非圆形振荡式生物反应器平均剪切率的增加将加大细胞的损伤程度，但只要反应器转速不超过50rpm，方形和椭圆形振荡生物反应器的最大平均剪切率小于16.795s-1，仍能满足细胞培养环境的要求。　　（3）研究了方形振荡式生物反应器转角半径对流动特性的影响。随着转角半径的增大，方形振荡式生物反应器的湍动能耗散率和单位体积氧传质系数kLa减小，混合和溶氧性能逐渐减弱，平均剪切率也逐渐降低。综合考虑混合、溶氧性能和平均剪切率，额定容积6.5L的方形振荡式生物反应器转角半径宜取72.5mm。　　（4）研究了椭圆形振荡式生物反应器长短轴比对流动特性的影响。随着长短轴比的增大，椭圆形振荡式生物反应器的湍动能耗散率和单位体积氧传质系数kLa增大，混合和溶氧性能逐渐加强，平均剪切率也逐渐提高。当长短轴比为1.4时，椭圆形振荡式生物反应器的平均剪切率为16.63s-1，处于细胞培养的最佳平均剪切率范围，因此额定容积6.5L的椭圆形振荡式生物反应器长短轴比应小于等于1.4。　　（5）研究了工艺参数对振荡式生物反应器流场特性的影响。发现相比圆形结构，两种非圆形结构在混合、溶氧方面都具有较大的优势，也能在较大的工作体积下保证培养效率。随着转速提高，振荡式生物反应器的湍动能耗散率、单位体积氧传质系数kLa和平均剪切率增大。随着工作体积增大，方形和椭圆形振荡生物反应器的平均剪切率和单位体积氧传质系数kLa不断减小，而湍动能耗散率呈现先增大后减小的变化规律。

关键词： 微藻   氮磷   尿液   填料   微藻光生物反应器  

摘要： 在生活污水中,人体尿液体积只占其总量的1%,但约80%氮和50%的磷酸盐来自于尿液,因此尿液是城镇生活污水的主要氮磷来源。研究高效廉价的尿液中的氮磷去除技术,既可以减轻污水处理厂处理氮磷的负荷,也能深入推动乡镇“厕所革命”向纵深发展。本研究针对城镇生活污水中的尿液氮磷含量较高的问题,在分析和比较现有微藻废水处理方法的基础上,筛选出适宜在尿液生长的微藻,开展微藻处理尿液研究。分析不同的条件下微藻对尿液中氮磷的去除效果,构建微藻光生物反应器,考察其运行过程中人尿液中氮磷的去除,为尿液等高氨氮废水的处理提供技术理论支持。本研究对比了小球藻、螺旋藻、栅藻和盐藻在合成尿液中的生长能力,其中小球藻及螺旋藻在尿液中具有较高生物量。在比较不同条件下小球藻及螺旋藻在尿液中的生长情况后,确定了两种藻在尿液中生长的最佳培养条件。实验得出小球藻所适宜接种量为15%和20%,螺旋藻接种量为5%和10%时长势更优;小球藻比螺旋藻更能适应高氨氮的尿液环境;外加葡萄糖对小球藻生物量浓度提升0.35×10个/mL,螺旋藻提升0.1 g/L;小球藻的CO浓度越高生长速度越快,而螺旋藻CO浓度为4%时生物量浓度提升至1.12 g/L,CO浓度为12%时反而降至0.53 g/L。本研究考察不同条件对微藻去除氮磷污染物的影响,得出小球藻及螺旋藻最适宜的接种量不同;小球藻在高氨氮浓度的合成尿液中对氨氮去除率高于螺旋藻,为52%;加入葡萄糖对小球藻与螺旋藻的氨氮去除率分别提升4.9%及4.6%,效果不明显;CO浓度为4%时小球藻及螺旋藻的氨氮去除率分别达到58.6%及63%。将微藻与沸石联用进行合成尿液与实际尿液的对比实验,发现小球藻在实际尿液中的氨氮去除率比在合成尿液中提高2.2%。在此基础上构建微藻光生物反应器并对实际尿液进行处理,得到微藻光生物反应器对实际尿液中氮磷的去除能力较强,反应器对氨氮的最高去除率为74.8%,对磷酸盐的最高去除率为77.6%。说明微藻较适宜与填料结合应用在实际尿液处理中。对试验进行吸收动力学分析与物料衡算,证实在试验的初期阶段微藻对氨氮的吸收速率比后期分别高1.003 mg/g?h及0.987 mg/g?h,而尿液中去除的氨氮有87%左右用于微藻自身生长繁殖,其余氨氮通过填料的吸附作用去除。此外对微藻光生物反应器进行经济分析,得出处理规模为160m/d尿液40 m中试规模的微藻光生物反应器处理尿液的运行费用为12.57万元/年,2.16元/m,收益主要来源包括:固碳效益、尿液处理效益、回收生物质收入。综上,微藻光生物反应器能够有效去除尿液中的氨氮,且经济成本较低,具有潜在的工程应用前景。

关键词： 生物反应器   流场特性   剪切敏感   细胞培养   数值模拟  

摘要： 生物反应器(Bioreactor,BR)是生物制药工业中大规模生产的核心装置之一。不论是利用丝状微生物如丝状真菌和丝状放线菌,还是高等动、植物细胞作为宿主生产抗生素、重组蛋白、治疗性抗体和重组疫苗等药物,都有着扩大生产规模的市场需求。生物反应器在这些细胞培养放大过程中面临的一个共同主要矛盾是如何应对剪切敏感型细胞。即在工业规模的生物反应器放大过程中,如何在高混合与低剪切的性能需求之间寻得最佳平衡。为此,本论文以剪切敏感型的哺乳动物细胞和微藻细胞的培养为对象,对生物反应器的设计、应用与评估方法进行了研究。内容包括基于生物反应器流场特性的实验分析与流场数值模拟方法相结合的反应器搅拌系统设计与优化、剪切敏感型生物反应器及空气分布器的系统设计,以及气升式微藻反应器的设计研究等方面。具体研究结果如下:1)采用粒子图像测速系统(Particle image velocimetry,PIV),测定了动物细胞反应器常用5种搅拌桨组合下的流场数据,计算得到了反应器内时间平均的流场分布、能量耗散率分布以及剪切率分布规律等。从角度(Angle-resolved)解析的流场分布可以发现双层相同形式的搅拌桨组合包括两组三叶大倾角桨式搅拌器(2LPBI3)、四宽叶螺旋桨式搅拌器(2FBMI4)、三斜叶涡轮式搅拌器(2PBT3)形成较稳定的轴向循环,但反应器内均存在因流速过大或速度分布极度不匀而造成局部混合不均匀现象。混合型双层搅拌组合(PBT3-LPBI3和PBT3-FBMI4)在轴向大循环的基础上均形成了 2-3个小的轴向循环,对于底物的混合和细胞的悬浮具有很好的效果。实验结果表明:通过三叶大倾角桨式型和三斜叶涡轮式搅拌器(LPBI3-PBT3)的组合,可以在显著改善反应器内流体运动速度不均匀的同时,降低反应器内局部流体运动速度,从而达到提高整个反应器内混合效果和降低反应器内剪切率的效果。2)采用计算流体力学(Computational fluid dynamics,CFD)模拟方法对适合于动物细胞培养生物反应器进行优化,分别研究了标准的k-ε模型、RNG k-ε模型、SST湍流模型和k-o模型等4种湍流模型对数值模拟结果的影响,并将CFD模拟得到的速度场、能量耗散率和剪切率分布与PIV实验结果进行对比分析。分析结果表明由标准的k-ε模型得到的结果与PIV实验结果最接近。基于以上优选的CFD模型对5组轴流型搅拌桨组合的流场进行了模拟分析,获取了反应器内的流场、气含率和剪切力分布等特征。结果表明:三窄叶变截面螺旋桨式搅拌组合(2HBMI3)形成的平均剪切力是0.4 Pa为5组组合中最小,相比较而言三宽叶螺旋桨式与三叶大倾角桨式组合(LPBI3-FBMI3)所形成的平均剪切力约为0.53 Pa为比较中最大值。而通过最大剪切力的比较发现,二叶大倾角桨式(2LPBI2)搅拌桨组合形成的最大剪切力为26.95 Pa,是其它搅拌桨组合的3至8倍,而三宽叶螺旋桨式搅拌桨组合(2FBMI3)形成的最大剪切力是3.85 Pa为比较中的最小值。通过构建的重组CHO细胞在不同搅拌组合形式条件下的流加批次培养发现,细胞密度和抗体表达水平与反应器内的最大剪切率直接相关,在三宽叶螺旋桨式搅拌型式(2FBMI3)下的细胞密度和抗体表达水平均为最高。实验结果表明CHO细胞在悬浮培养时对剪切环境比较敏感,且最大剪切力是工业规模放大的关键因素。3)研制了孔径为2.0 μm的金属烧结微孔空气分布器,研究了微孔空气分布器的传递效果和对细胞培养的影响,并与孔径为2.0 mm的常规空气分布器进行了细胞培养性能比较。结果表明:微孔空气分布器和环形空气分布器均能保持细胞培养中pH和溶氧控制的稳定,但微孔空气分布器形成的气泡直径较小,从而由气泡破碎产生的剪切力较小,且由于氧气的传递能力更好,导致耗用气量较低。在CHO细胞培养条件下,配备微孔空气分布器的反应器内细胞成活率一直维持在95%以上,相对配备常规环形空气分布器的细胞成活率只有60%左右,说明由微孔空气分布器形成的气泡由于直径较小,故破碎时产生的会对CHO细胞可能造成伤害的剪切力也较小,且氧传质性能更强,有利于动物细胞的生长。4)研究了不同规模的一次性锥底宽体生物反应器内的流场特性,实现了反应器的理性放大。首先采用CFD模拟方法,对7 L,50 L,200 L和1000 L一次性锥底宽体生物反应器的流场进行模拟。结果表明:随着生物反应器规模的增加,反应器内的液面形态、流场分布、能量耗散率、传质系数(kL)均无显著差异。而剪切率、比传质面积(a)以及氧体积传质系数(kLa)随着反应器规模的增大而逐渐减小。若培养体系主要受剪切率的影响,则1000 L的细胞培养结果应会比小试规模更好。然后通过在7 L,50 L,200 L和1000 L生物反应器上进行

关键词： 污水处理   膜生物反应器  

摘要： 膜生物反应器(Membrane Bioreaetor.简称(MBR)是一种新型高效的水处理技术.主要介绍了(MBR)工艺的原理、特点、分类及其在污水再生处理领域的应用情况.

关键词： 曲面混流桨   搅拌式生物反应器   计算流体力学(CFD)   流动特性   结构优化  

摘要： 生物反应器是细胞体外培养的核心装置,在生物医药领域发挥着越来越重要的作用。搅拌式生物反应器具有工艺简单、操作方便、细胞适应性好等特点,是目前使用最广泛的反应器结构。但反应器内部流场比较复杂,无法通过理论计算得到解析解,同时机械搅拌产生的剪切力将对细胞产生损伤作用,因此非常有必要对搅拌反应器内部流动特性进行详细数值模拟研究。本文对底入式生物反应器进行了流动特性模拟,开发了适用于细胞培养环境的曲面混流搅拌桨,并对搅拌桨结构参数进行了优化设计。论文的主要研究工作和取得的成果如下:(1)建立了搅拌式生物反应器模型,采用多重参考系法(MRF)对反应器内的流场进行了数值模拟计算。模拟得到速度场与实验结果进行了比较,发现两者吻合较好,验证了模拟方法的准确性与可行性。比较了Standard k-ε、RNG k-ε和Realizable k-ε三种湍流模型的模拟结果,发现RNG k-ε模型的模拟结果与实验测量值的偏差较其他两种湍流模型大。(2)研究了RT桨、PBT桨、EE桨和B-EE桨四种搅拌桨对生物反应器流动特性的影响。结果表明,采用本文提出的B-EE桨反应器,其平均湍动能最大,剪切率水平较低,兼有良好混合性能和较小剪切率的优点,是细胞培养生物反应器的首选搅拌桨。RT桨反应器内部的流动循环与其他三种差别较大,其流动循环主要分布于邻近反应器筒壁区域,不利于物质的整体混合,所以一般不适用于底入式生物反应器。(3)曲面混流搅拌器主要结构参数包括扇叶宽度、搅拌器外径与反应器内径比和桨叶与搅拌轴的夹角。本文采用三因素三水平正交试验法,分析了曲面混流搅拌桨结构参数对生物反应器流动特性的影响。综合考虑良好混合效果和低剪切率的要求,得到最优的曲面混流搅拌器参数为:搅拌器与轴的夹角60°,扇面宽度90°和搅拌器外径与釜体内径比1/2。(4)研究了搅拌桨转速(150rpm,200rpm,250rpm,300rpm,350rpm和400rpm)对反应器内流动特性的影响。反应器内流体的湍动能、湍动能耗散率和剪切率随着速度的增大而增大。当转速为250rpm时平均剪切率为14.4(1/s),最适合细胞的生长。本文提出的曲面混流桨适用于底入式生物反应器,兼具良好混合性能和低剪切率的特点,对于生物反应搅拌器的开发具有重要的参考价值。后续的研究可围绕激光粒子成像技术(PIV)和激光多普勒测速技术(LDA)等方法进行实验测量。

关键词： 高氨氮废水   微生物群落结构   菌藻膜生物反应器  

摘要： 高氨氮废水处理一直是污水处理领域的重要难题之一，采用菌藻共生系统处理高氨氮废水得到了日益普遍的关注。本论文主要考察了菌藻共生系统在不同运行条件下处理高氨氮废水的运行效果和微生物群落结构信息，探讨了不同工况下的氮转化机制。　　本论文首先以硝化污泥膜生物反应器(MBR，Membrane bioreactor)为对照，考察了在不同进水氨氮浓度条件下，菌藻MBR处理高氨氮废水性能及氮转化机制。实验结果表明，在控制系统pH在8.3±0.2，进水氨氮浓度由217.2±3.9mg/L提高至856.3±28.3mg/L时，氨氮去除率达99.1%以上，菌藻MBR抗冲击负荷能力强于硝化污泥MBR。随着进水氨氮浓度的增加，菌藻MBR系统中amoA和nxrA基因相对丰度呈下降趋势;小球藻光合作用功能基因rbcL相对丰度呈先上升后下降趋势。通过冗余分析(RDA)分析表明，系统中亚硝氮、硝氮、pH和胞外聚合物(EPS)对微生物群落结构影响程度较大，不同运行条件下，虽然菌藻MBR系统均能实现氨氮的完全转化，但系统内环境因子和菌群结构均存在着较大差异，群落优势菌属中大部分菌属(如Nitrosomonas、Nitrobacter等)与EPS、硝氮和pH呈正相关，和氨氮、亚硝氮呈负相关。　　本论文还考察了不同浓度有机碳源对菌藻MBR系统处理高氨氮废水性能及氮转化机制的影响。实验结果表明，进水COD浓度分别为0mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L和500mg/L时，氨氮去除率均达99.3%以上，出水COD浓度均低于60mg/L。当进水COD浓度高于50mg/L时，SOURAOB与SOURNOB比值急剧降低且趋于稳定。与进水COD浓度相对应的谷氨酸脱氢酶(GDH)与谷氨酰胺合成酶(GS)比值分别为16.9、11.7、10.4、8.9、7.9，小球藻异养生长程度增加。当进水COD浓度达到500mg/L时，抗氧化酶活性系统失衡，膜脂质过氧化程度增加。随着进水COD浓度的升高，amoA、nxrA和rbcL基因相对丰度均呈下降趋势。RDA分析表明，菌藻MBR系统中亚硝氮、硝氮和pH对微生物群落结构影响较大。COD与氮转化相关的微生物Nitrosomonas和Nitrobacter呈负相关，进水COD浓度能影响氮转化形式，改变系统中菌群结构。小球藻自养生长关键酶GDH和rbcL基因与异养生长GS呈负相关，随着进水COD的增加，小球藻混养生长，自养生长程度减弱。　　本论文以硝化曝气生物膜反应器(MABR，Membrane aerated biofilm reactor)为对照，考察了不同进水氨氮负荷下，菌藻MABR处理高氨氮废水的运行特性和氮转化机制。实验结果表明，菌藻MABR比硝化MABR的氨氮转化效率更高。随着进水氨氮负荷的增加，菌藻MABR优势趋于明显，微藻能促进氨氮向亚硝氮转化，提高氨氮转化能力。进水氨氮负荷为8.14±0.10gN/(m2?d)时，菌藻MABR氨氮去除负荷为4.84±0.15gN/(m2?d)。当进水氨氮负荷提高至12.54±0.22gN/(m2?d)时，由于溶解氧和生物膜内生物量的双重限制，氨氮去除负荷并未增加，稳定运行时氨氮去除负荷为4.74±0.25gN/(m2?d)。菌藻MABR生物膜中TB-EPS含量占总EPS含量均高于硝化MABR，菌藻生物膜比硝化生物膜更为致密。连续提高进水氨氮负荷时，菌藻MABR生物膜中amoA基因相对丰度一直增加，nxrA基因相对丰度先减少后趋于稳定，rbcL基因相对丰度先显著增加后减少。　　最后，本论文考察了菌藻MABR处理实际养猪沼液的运行特性。实验结果表明，菌藻MABR处理氨氮浓度为54.1±3.2mg/L的养猪沼液时，氨氮去除负荷达到2.22±0.15gN/(m2?d)。当进水转为氨氮浓度为113.4±5.0mg/L的养猪沼液时，反应器运行不稳定，出水水质波动较大，生物膜中LB-EPS占总EPS比例增加至78.6%，生物膜结构逐渐由致密趋于疏松导致脱落。进水恢复为氨氮浓度为60.5±7.3mg/L的养猪沼液后，氨氮去除负荷缓慢恢复至1.72±0.31gN/(m2?d)，去除率为65.7%。处理不同浓度的养猪沼液时，群落菌属发生较大变化，并且呈不同的变化模式。RDA分析表明，菌藻MABR系统中亚硝氮、硝氮、COD和EPS对微生物群落结构影响较大。COD与氮转化相关的菌属Nitrosomonas、Nitrobacter呈负相关，与Nitrospira呈正相关;Nitrosomonas、Nitrobacter与亚硝氮、硝氮呈负相关;功能基因nxrA与光合作用基因rbcL呈正相关。NOB对于环境较为敏感，菌藻之间形成的微环境能增加NOB对环境的耐受力，能促进NOB的活性，增加nxrA基因的表达。　　本

关键词： 轮状病毒   纳米疫苗   VP6   Ferritin   乳腺生物反应器   水稻表达  

摘要： 生物反应器搭建了现代动物生物技术与药用蛋白表达制药技术的桥梁,是现代生物技术领域的研究热点,应用生物反应器来制备口服疫苗的研究,国内外鲜有报道。本研究针对人畜共患轮状病毒病,设计了口服铁蛋白纳米疫苗生物反应器,并通过小鼠模型,对其免疫原性与保护能力进行了初步的验证。研究结果如下:1、人轮状病毒VP6蛋白及铁蛋白Ferritin的原核表达及功能研究通过NCBI数据库获取人轮状病毒VP6基因和铁蛋白(Helicobacter pylor/non-haem iron-containing ferritin)的核苷酸序列,并克隆到pET-32a载体上。之后使用大肠杆菌表达系统表达得到了 rferritin,rVP6以及rVP6-ferritin融合蛋白,并对三种蛋白的IPTG诱导浓度、诱导时间和起始诱导菌液浓度(OD600)等表达条件进行了优化探索。通过Ni2+亲和层析及分子筛等方法纯化得到了 ferritin,rVP6和rVP6-ferritin蛋白。使用透射电子显微镜观察复性后的ferritin蛋白和VP6-ferritin可见两种蛋白可以形成相似的纳米颗粒,粒径均一。使用纯化得到的重组蛋白对小鼠进行灌胃免疫可以诱导小鼠产生anti-VP6特异性的IgG和IgA抗体,且使用rVP6-ferritin蛋白对小鼠进行灌胃免疫可以显著提高小鼠的体液免疫和粘膜免疫应答,与添加免疫佐剂效果相当。2、rVP6-Ferritin重组蛋白乳腺特异性表达载体的构建及功能检测对轮状病毒VP6基因和铁蛋白ferritin基因序列按哺乳动物偏好性密码子进行了优化和合成,并定向克隆入乳腺特异性表达载体pBC1中。将pBC1-rVP6-ferritin-EGFP-IRES-Neo载体用核转染仪转染乳腺癌细胞系Bcap-37细胞,转染24h后在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光蛋白GFP的表达,RT-PCR检测到GFP和rVP6-ferritin基因mRNA的表达,Western-blot成功检测到60 kDa的rVP6-ferritin蛋白条带。3、轮状病毒VP6-ferritin纳米疫苗乳腺生物反应器小鼠模型的制备与检测使用显微注射仪注射到小鼠的受精卵中,并将受精卵移植入受体小鼠。结果显示,共有5只founder小鼠(3只雌性和2只雄性)整合了 rVP6-ferritin基因,rVP6-ferritin基因在可以在转基因雌性小鼠的乳腺中表达,且该表达仅限于哺乳期转基因小鼠的乳腺中。乳汁中外源蛋白的浓度为52.04 mg/L到125.25mg/L。对小鼠的血清IgG及小肠粘膜IgA抗体检测,结果显示通过转基因阳性小鼠母乳获得的rVP6-ferritin蛋白可以成功诱导小鼠产生血清免疫和粘膜免疫。使用200倍TCID50浓度的SA-11轮状病毒对5日龄的乳鼠进行攻毒试验结果显示,转基因母鼠喂养的小鼠在攻毒后只有部分发生轻度的腹泻症状,且很快恢复健康,而野生型母鼠喂养的小鼠在攻毒后都发生了重度腹泻症状,且持续了 5天以上,并造成一只小鼠死亡。其余小鼠虽然在第8天恢复健康,但其生长发育状况受到了严重干扰,身体消瘦,体重显著偏低。4、利用转基因水稻生产轮状病毒纳米疫苗的初步研究通过将rVP6-ferritin基因序列按照水稻偏好性密码子进行优化,并构建了一个水稻过表达rVP6-ferritin基因载体和两个水稻胚乳特异性表达rVP6-ferritin基因载体。成功获得了三个转基因水稻品系,并使用RT-PCR和Western blot试验检测到rVP6-ferritin基因的mRNA的转录和蛋白的表达。由于在后续扩大种植试验中水稻出现了外源蛋白表达量降低和外源基因沉默的现象,对水稻中表达的rVP6-ferritin蛋白的功能还需要进一步研究。结论:原核表达获得的重组蛋白rVP6-ferritin具有与rVP6相似的抗原性,并可以在细胞外自组装为与ferritin类似的均一球形纳米粒子。使用纯化的rVP6-ferritin重组蛋白对小鼠进行灌胃免疫可以诱导小鼠产生anti-VP6特异性的血清IgG和小肠粘膜IgA抗体,且rVP6-ferritin蛋白诱导产生的anti-VP6特异性血清IgG和小肠粘膜IgA抗体滴度显著高于rVP6蛋白。转染乳腺特异性表达载体pBCl-rVP6-ferritin可以在Bcap37细胞中表达具有VP6抗原性的rVP6-ferritin蛋白。在转pBCl-rVP6-ferritin基因小鼠的乳腺中可以特异性表达及分泌rVP6-ferritin蛋白。小鼠直接饮用该乳汁可以诱导小鼠产生anti-VP6特异性的血清IgG和小肠粘膜IgA抗体,并可以保护5日龄的乳鼠免于轮状病毒感染或减轻感染症状。转基因水稻可以应用于rVP6-ferritin蛋白的表达,

关键词： 生物反应器   MDCK细胞   甲型H3N2流感病毒  

摘要： 流感即流行性感冒,是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染性疾病。流感病毒属于正黏科病毒,可分为甲、乙、丙三种类型。甲型H3N2流感病毒是最常见的季节性流感病毒,也是目前多价流感疫苗中主要组成部分。流感疫苗以鸡胚培养法生产的传统疫苗为主,这种传统生产工艺虽然成熟,但存在产量不稳定、生产周期长、病毒易变异、易引起过敏反应等缺点。相对于鸡胚,生物反应器大规模生产细胞基质流感疫苗工艺生产过程操作简单且易于控制,生产周期短,自动化程度高,疫苗质量稳定、安全,具有绝对优势。而MDCK细胞为目前公认的对流感病毒敏感的细胞株之一。本研究将甘肃省动物细胞工程技术研究中心保存的MDCK细胞,按照《中华人民共和国药典》(三部)对生产疫苗用细胞要求,从生物学特性、微生物污染和遗传特性鉴定建立MDCK细胞库,其复苏活力为96%,培养48h细胞生长致密单层,形态多呈三角形和不规则多角形,与冻存前的形态基本一致;生长曲线呈“S”型,最大增殖密度为5.45×10～5cells/mL,倍增时间为23.2h,连续培养10代时形态和生长速度保持一致;真菌、细菌、支原体和内、外源病毒因子检测为阴性;染色体众数在78～82之间。通过生长特性研究筛选用于培养MDCK细胞的培养基和载体。结果表明,MDCK细胞用DMEM培养基培养倍增时间为20.2h,最大增殖密度9.58×10～5cells/mL,传代培养10代生长良好,优于DM/F12、MEM和M199培养基;生物反应器Cytodex-1微载体和片状载体培养MDCK细胞。结果表明,Cytodex-1微载体和片状载体均能支持MDCK细胞生长,但是在相同体积的反应器中片状载体培养MDCK细胞最大增殖密度6.18×10～6cells/mL明显高于Cytodex-1微载体3.21×10～6cells/mL,因此本研究选用片状载体培养MDCK细胞,进行后期试验研究。生物反应器片状载体培养建库的MDCK细胞增殖甲型H3N2流感病毒并对增殖条件进行优化。结果表明,本研究中生物反应器增殖甲型H3N2流感病毒最优TPCK-胰酶浓度为2.5μg/mL,最优MOI为0.01;当所收获的病毒液用于生产流感疫苗时,收毒时间以72h为宜;当所收获的病毒液作为继续扩增流感病毒的种毒时收毒时间以60h为宜。通过本研究,优化了高密度培养MDCK细胞增殖甲型H3N2流感病毒的条件,为生物反应器培养哺乳动物细胞生产流感疫苗的大规模生产提供参考依据。

关键词： 陶瓷膜   膜生物反应器   农村生活污水   强化脱氮   吸附除磷  

摘要： 我国农村污水处理设备缺乏,大量农村生活污水未经处理直接排放造成了大面积的水体污染。陶瓷膜生物反应器作为新型水处理工艺,是未来农村生活污水处理主要方向。本文通过考察陶瓷膜生物反应器对农村生活污水处理效果,针对存在问题进行工艺参数优化,最后强化脱氮除磷工艺,旨在提高工艺出水水质至一级A排放标准。研究表明:一.常规运行条件下,陶瓷膜生物反应器对农村生活污水处理效果:1.进水化学需氧量（COD）、总氮（TN）、氨氮（NH4+-N）、总磷（TP）浓度分别为461.00～561.00、33.97～54.00、18.70～29.67和4.78～5.77 mg/L时,相应的平均去除率达到86.87%、47.64%、95.00%、12.32%,出水平均浓度分别为67.48、22.59、1.13、4.57 mg/L。其中陶瓷膜对有机物的拦截率为79.94%。出水水质不满足一级A排放标准;2.进水大肠杆菌浓度为8.70×10～51.50×10～6 MPN/100mL,经剂量35 mJ/cm2的紫外线照射后,出水大肠杆菌平均浓度为35 MPN/100mL,满足一级A排放标准;3.12 min抽吸、3 min反冲洗的运行模式能延缓膜污染,1000 mg/L次氯酸钠溶液可有效清除附着在膜上的污染物,并恢复初始膜通量;二.运行参数优化研究结果:1.优化膜孔径为50nm、膜通量为20 L/（m2·h）,陶瓷膜对有机物拦截率可达92.86%,膜清洗周期可达37 d;2.优化污泥负荷为0.35-0.60 kgCOD/（kg污泥·d）,COD、NH4+-N去除率分别可达95.33%、95.15%,出水平均浓度为24.01、1.87 mg/L,满足一级A排放标准,出水TN、TP不达标;三.脱氮除磷工艺强化研究结果:1.当回流比为200%、DO为2.00 mg/L、缺氧池HRT为3.00 h、厌氧池HRT为2.00 h,TN去除效果可达69.64%,出水平均浓度为11.73 mg/L,满足一级A排放标准;2.利用粉煤灰多孔填料吸附除磷,最佳水力负荷1.40 m3/（m3·d）时,TP平均去除率达93.17%,出水满足一级A排放标准;陶瓷膜生物反应器是新型水处理工艺之一,在农村生活污水处理方面具有重要的应用潜力。本文考察了陶瓷膜生物反应器对农村生活污水处理效果,优化了运行参数,完善强化了脱氮除磷工艺,构建了一套完整的陶瓷膜处理农村生活污水工艺流程,为陶瓷膜生物反应器处理农村生活污水提供了非常重要的应用参考。

关键词： 养殖废水   脱氮处理   生物基质材料   降解速率  

摘要： 近年来，由于养殖业快速发展引起的水环境污染问题，引起广泛关注，大量未经处理的畜禽养殖废水随意排放造成了河流和湖泊水体的严重富营养化。人工湿地技术已被广泛应用于农业源污水的生态治理，但由于养殖场直排废水负荷高，易造成湿地植物无法生长、处理效率低等问题。基于此，本研究通过为期一年的野外控制试验，探讨利用常见的农作物秸秆降低污染负荷的可行性，目的在于使养殖废水通过前端预处理，以使得废水浓度达到湿地植物能够耐受的范围。试验设置麦秸、稻草、玉米秆和空白对照(CK)4组处理，3次重复，设定为连续式进水，水力停留时间为7d，主要比较分析三种基质材料对猪场废水中化学需氧量(COD)、总氮(TN)、氨氮(NH4+-N)的去除效率，测定生物基质池中与氮循环相关的功能基因丰度，并分析三种基质材料木质素、纤维素和半纤维素的降解过程，以期初步阐明基质材料脱氮的微生物机理，为养殖废水的生态治理提供理论依据，为关键工程参数的确定提供数据支撑。　　试验结果表明:　　1)三种作物秸秆对养殖废水COD、TN及NH4+-N等主要污染物的去除率均以前6个月为最佳，之后去除效果则明显下降，污染物年均去除率均在25.8％～35.3％，但三种作物秸秆的表现则不尽一致，其中麦秸及玉米秆对COD的去除效果相对较好，而稻草及麦秸对TN与NH4+-N的去除效果则较好。　　2)三种作物秸秆降解速率具显著差异，其中稻草的干物质年降解率最高(77.5％)，其次为麦秸(70.8％)，玉米秆降解最慢(67.4％)，但均以前6个月为主要降解阶段(＞50％)。表明生物基质池中基质材料的补充时间以5～6个月为最佳。秸秆主要构成成份中以纤维素的降解速率为最快，年降解率为92.2％～96.0％，其次为半纤维素，为93.2％～95.6％，而木质素降解最为缓慢，仅为85.8％～89.6％。　　3)三种秸秆添加对基质池N转化影响的微生物机理略有差异，其中稻草和麦秸处理hzsb基因与nirS基因丰度相对较高，表明添加稻草和麦秸会强化基质池厌氧氨氧化和反硝化微生物的氮转化作用，而添加麦秸处理的AOA与AOB基因丰度相对较高，表明麦秸主要是促进了生物基质池的硝化作用。