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关键词： 硝酸盐型厌氧甲烷氧化   膜生物反应器   水力停留时间   颗粒活性炭  

摘要： 硝酸盐型厌氧甲烷氧化（Nitrate-dependent anaerobic methane oxidation,N-damo）是微生物在厌氧条件下利用甲烷作为电子供体还原硝酸盐的过程。该过程耦联了硝酸盐还原和甲烷氧化,具有脱氮除甲烷双重功能,对认识地球碳氮元素循环和开发废水处理技术具有科学意义和实践价值。但驱动该过程的功能微生物世代时间长,对其生长的环境调控因子不清楚,生物量增加困难,污染物去除速率低。研究基于膜反应器（Membrane bioreactor,MBR）持留微生物、活性炭强化甲烷供给能力为微生物提供载体的理论分析,将膜反应器与N-damo过程进行耦合形成N-damo-MBR工艺,开展了该工艺的脱氮性能实验、水力停留时间（Hydraulic Retention Time,HRT）影响实验和颗粒活性炭（Granular activated carbon,GAC）强化实验,统计分析了氮转化效率、速率和负荷率等指标,调查了基质反应动力学,鉴定分析了微生物群落结构及其变化,探究了N-damo-MBR工艺潜力并解析其内在机理。研究得到的主要结论如下:（1）MBR能有效增收N-damo微生物,提升基于N-damo的脱氮性能。利用MBR培养N-damo微生物经历了适应期、快速增长期、缓慢增长期三个过程,脱氮速率从9.78±2.68 mgN·L-1·d-1上升到44.91±5.71 mgN·L-1·d-1,增大了3.6倍。化学计量学关系验证结果表明N-damo-MBR工艺中实际N/C消耗比为1.600±0.094,接近理论值1.6。反应器的膜污染周期为25d。（2）HRT显著影响N-damo-MBR工艺的脱氮效能和微生物群落结构。反应器的总氮去除率在HRT为3d时达到最大值100%。总氮去除负荷和硝氮去除速率在HRT为1.5d时达到最大,分别从初始的17.23 mgN·L-1·d-1提升到44.20mgN·L-1·d-1、从11.74±0.84 mgN·L-1·d-1上升到48.11±1.34 mgN·L-1·d-1。HRT的选择应根据不同的处理目的而定。缩短HRT会加剧N-damo-MBR工艺膜污染现象。Candidatus Methanoperedens和Candidatus Methylomirabilis是N-damo-MBR体系中的优势微生物。ANME-2d的16SrRNA和功能基因甲基辅酶M还原酶（mcrA）丰度均有所提高,且都在HRT为1.5d时达到最大。NC10的16SrRNA和功能基因颗粒性甲烷单加氧酶（pmoA）丰度较初始状态均有所提高,二者在3d的HRT下达到最大值。（3）外加GAC能有效提升N-damo-MBR反应器的效能。加入GAC后脱氮速率从10.29 mgN·L-1·d-1增长至31.85±3.19 mgN·L-1·d-1,增大了2.08倍。脱氮效率也从前22d的35.10±3.20%上升到45d的100%并维持稳定。GAC表面的多孔结构有利于微生物附着,其甲烷吸附性能增大了微生物利用甲烷的机会和供给量,且能有效延缓膜污染速度。反应器内微生物群落结构明显优化,N-damo古菌隶属的Euryarchaeota门相对丰度从64.3%上升到86.2%,N-damo细菌隶属的NC10门相对丰度从27.1%上升到56.9%,且大部分在加入GAC前占优的微生物种属相对丰度产生了明显下降。qPCR结果表明,ANME-2d的16SrRNA以及NC10的功能基因pmoA丰度均有所提高,表明GAC能有效提高N-damo微生物的丰度,进而提高微生物的代谢活性。

关键词： hVEGF165   转基因   家蚕   生物反应器  

摘要： 鳞翅目昆虫家蚕(Bombyx mori)是重要的产丝昆虫,至今已被人类饲养利用逾5000年。家蚕丝腺是合成和分泌蚕丝蛋白的专一场所(一头家蚕可生产约0.5克丝蛋白),是蚕丝业最为核心的生物学基础。近些年来,随着生物技术的蓬勃发展,特别是近年在家蚕基因组计划的推动下,人们对丝腺高效合成与分泌丝蛋白的分子机制有了深入了解,同时也注意到家蚕不仅能用于产丝织绸,其丝腺还是一个理想的生物反应器。2003年,日本学者首次报道了利用转基因家蚕丝腺表达重组人Ⅲ型胶原蛋白,其后,国内外学者利用转基因家蚕丝腺已成功表达了数十种外源蛋白,少数重组蛋白素材已进入中试或产业化生产阶段,表明利用家蚕丝腺作为生物反应器生产重组蛋白,有着巨大的开发应用潜力。人血管内皮生长因子(human vascular endothelial growth factor,hVEGF)是一种对内皮细胞具有高度特异性的有丝分裂原,在血管再生和血管发生中起着重要作用。hVEGF165是hVEGF-A亚型中组织表达频率最高、最具生理相关性的一种异构体,在外周缺血性疾病或慢性伤口的治疗性血管再生研究中效果显著。目前,重组hVEGF165蛋白主要采用大肠杆菌、酵母等原核或低等真核表达系统进行体外表达和研究,其是否适合在家蚕中部丝腺表达尚不清楚。本论文以hVEGF165为靶标,探索利用转基因家蚕中部丝腺表达hVEGF165的可行性,以期为进一步开发重组hVEGF165蛋白提供理论参考和转基因素材基础。取得的主要研究结果如下:***165转基因家蚕的制作首先,从NCBI下载hVEGF165基因序列(NP01020539.2),根据家蚕密码子偏好进行密码子优化后直接合成在C末端融合有6×His标签的hVEGF165序列。其次,采用酶切连接方式,将合成序列组装到以家蚕丝胶1基因(Sericin-1,Ser1)启动子为调控元件的亚克隆载体pSL1180[hSer1sp-DsRed-Ser1]上,进而再装到piggyBac骨架载体,构建成转基因表达载体pB[hSer1sp-hVEGF165-Ser1,3×P3EGFP](简写为S1-V165)。最后,采用显微注射方法,将S1-V165超纯质粒DNA注射至家蚕早期胚胎,经荧光筛选获得了5个阳性蛾圈;基因组PCR及测序结果表明,转基因蚕制作成功,命名为S1-V165。***165的表达特征解剖获取S1-V165五龄幼虫的中部丝腺进行qRT-PCR检测,结果表明:在五龄第1天的中部丝腺中,hVEGF165的表达量逐渐增加,五龄第6天出现表达峰值,其mRNA含量是内源Ser1 mRNA总量的56%。随后对S1-V165五龄幼虫中部丝腺及茧壳溶解产物进行Western Blot检测,结果显示,在中部丝腺以及茧壳溶解产物中均能检测到目的蛋白,表明重组hVEGF165蛋白已成功在S1-V165家蚕中部丝腺细胞中合成并且分泌进入茧壳中。3.重组hVEGF165蛋白的促细胞增殖活性重组hVEGF165蛋白是否二聚体化是其有无生物学活性的关键。本研究分别利用PBS、8M尿素和弱碱溶液(5 g/L NaCO,4 g/L NaHCO)溶解S1-V165茧壳后进行Western Blot分析,结果表明:在存在或缺乏β-巯基乙醇(还原或非还原条件下)的条件下,重组hVEGF165蛋白分别以单体或二聚体形式存在。紧接着,将灭菌处理的S1-V165茧壳蛋白浓缩液与饥饿处理后的HUVE细胞共培养24 h后,分别进行CCK-8检测及EdU染色分析。结果表明:含有重组hVEGF165蛋白的弱碱溶液的促细胞增殖效果显著高于对照组,表明其具有促细胞增殖活性。随后,利用弱碱溶液分别处理细胞0、5、15、30 min后,进行Western Blot分析,结果表明,与对照组相比含有重组hVEGF165蛋白的弱碱溶液处理细胞后对pMAPK44/42的瞬时磷酸化相对较高,具备激活ERK通路从而促进内皮细胞增殖的作用。4.重组hVEGF165蛋白的释放特性取S1-V165茧粉90 mg于3 mL的弱碱液中溶解72 h,采用Western Blot测定弱碱液上清液中重组hVEGF165蛋白的释放行为。结果表明,重组hVEGF165蛋白在04 h内释放速度极快,达到总释放量的80%,242 h期间仍有少量释放。5.S1-V165茧片的促细胞增殖活性将干燥灭菌的S1-V165茧片浸泡在血清浓度为10%的培养基中,与人脐静脉内皮细胞共同培养24 h后进行观察发现,细胞形态及生长状态良好,与对照组相比无明显死亡;随后利用血清浓度为0.5%的培养基对细胞进行饥饿处理12 h,将茧片放入96孔板中与细胞共同培养72 h,利用CCK-8及EdU染色进行促细胞增殖分析,结果表明,S1-V165茧片处理

关键词： 微藻   氮磷   尿液   填料   微藻光生物反应器  

摘要： 在生活污水中,人体尿液体积只占其总量的1%,但约80%氮和50%的磷酸盐来自于尿液,因此尿液是城镇生活污水的主要氮磷来源。研究高效廉价的尿液中的氮磷去除技术,既可以减轻污水处理厂处理氮磷的负荷,也能深入推动乡镇“厕所革命”向纵深发展。本研究针对城镇生活污水中的尿液氮磷含量较高的问题,在分析和比较现有微藻废水处理方法的基础上,筛选出适宜在尿液生长的微藻,开展微藻处理尿液研究。分析不同的条件下微藻对尿液中氮磷的去除效果,构建微藻光生物反应器,考察其运行过程中人尿液中氮磷的去除,为尿液等高氨氮废水的处理提供技术理论支持。本研究对比了小球藻、螺旋藻、栅藻和盐藻在合成尿液中的生长能力,其中小球藻及螺旋藻在尿液中具有较高生物量。在比较不同条件下小球藻及螺旋藻在尿液中的生长情况后,确定了两种藻在尿液中生长的最佳培养条件。实验得出小球藻所适宜接种量为15%和20%,螺旋藻接种量为5%和10%时长势更优;小球藻比螺旋藻更能适应高氨氮的尿液环境;外加葡萄糖对小球藻生物量浓度提升0.35×10个/mL,螺旋藻提升0.1 g/L;小球藻的CO浓度越高生长速度越快,而螺旋藻CO浓度为4%时生物量浓度提升至1.12 g/L,CO浓度为12%时反而降至0.53 g/L。本研究考察不同条件对微藻去除氮磷污染物的影响,得出小球藻及螺旋藻最适宜的接种量不同;小球藻在高氨氮浓度的合成尿液中对氨氮去除率高于螺旋藻,为52%;加入葡萄糖对小球藻与螺旋藻的氨氮去除率分别提升4.9%及4.6%,效果不明显;CO浓度为4%时小球藻及螺旋藻的氨氮去除率分别达到58.6%及63%。将微藻与沸石联用进行合成尿液与实际尿液的对比实验,发现小球藻在实际尿液中的氨氮去除率比在合成尿液中提高2.2%。在此基础上构建微藻光生物反应器并对实际尿液进行处理,得到微藻光生物反应器对实际尿液中氮磷的去除能力较强,反应器对氨氮的最高去除率为74.8%,对磷酸盐的最高去除率为77.6%。说明微藻较适宜与填料结合应用在实际尿液处理中。对试验进行吸收动力学分析与物料衡算,证实在试验的初期阶段微藻对氨氮的吸收速率比后期分别高1.003 mg/g?h及0.987 mg/g?h,而尿液中去除的氨氮有87%左右用于微藻自身生长繁殖,其余氨氮通过填料的吸附作用去除。此外对微藻光生物反应器进行经济分析,得出处理规模为160m/d尿液40 m中试规模的微藻光生物反应器处理尿液的运行费用为12.57万元/年,2.16元/m,收益主要来源包括:固碳效益、尿液处理效益、回收生物质收入。综上,微藻光生物反应器能够有效去除尿液中的氨氮,且经济成本较低,具有潜在的工程应用前景。

关键词： 氧传质   ASM2D   串级控制   节能降耗   两相流速   紊动动能  

摘要： 好氧技术是主要的水处理技术,可去除大部分污染物,但存在曝气控制及溶解氧利用不均衡的问题。过高的曝气量会扰动泥水分离,影响出水水质,增加能耗;过少的曝气量导致污染物去除率降低。因此,研究氧传质及影响因素,为污水厂的曝气控制提供参考依据,从而达到降低能耗的目的。本文包括两方面的内容,一是好氧生物反应器氧传质过程与能耗研究。基于ASM2D模型,对污水厂进行建模,通过曝气控制模拟及高级实验分析,确定曝气控制方式及最佳运行参数,并分析各工况下的能耗、氧传质系数、溶解氧浓度。二是好氧生物反应器水力特性对氧传质效果的数值模拟。以计算流体力学为基础,通过Euler-Euler和标准k-ε模型对好氧生物反应器进行模拟计算。从气液两相流速、气体体积分数、紊动动能分析反应器内两相混合程度及氧传质效果。具体结论如下:(1)好氧生物反应器氧传质过程与能耗研究表明:1)相比于KLa控制,串级控制的曝气能耗较低;2)全局敏感性分析:f、f、f、r、v0对出水COD的敏感性比较显著;3)参数估计:模拟出水COD为20.49～35.97mg/L,f=0.4905,f=0.4879,f=0.0107,f=0.8670,r=0.0157m3/g,v0=468.92m/d;4)终值优化:相较于基态模拟,出水TP为0.32mg/L,曝气能耗降低了50.36%,总能耗降低了41.6%。好氧池内KLa为100.56～227.14d-1,DO为1mg/L或2mg/L;5)不确定性分析:当S为0.14～0.2mg/L,出水COD为18～26mg/L,概率分布为50%～95%,所建模型的出水相对稳定。(2)好氧生物反应器水力特性对氧传质效果的数值模拟表明:通过验证,Euler-Euler结合标准k-ε模型可对AAO反应器进行较好地模拟,能真实反映AAO反应器中的气液水力特性。AAO反应器模拟结果显示,DO=2mg/L,供氧量6m3/h,气液两相流速、紊动动能在z=1.5m处达到最大,氧传质效果最佳。

关键词： 微藻   光生物反应器   气液传质   正渗透   污染机制  

摘要： 20世纪90年代以来,大量温室气体排入环境中,造成了全球气温的持续增长。CO2作为最重要的温室气体,对全球变暖的贡献率约占所有温室气体的60%,因此CO2减排迫在眉睫。微藻作为一种能够利用光合作用进行高效固碳的自养型生物,每100吨藻生物质可以固定大约183吨CO2,并产生具有极高经济价值的藻生物质。但在实际微藻规模化培养和CO2固定的过程中,微藻光生物反应器投资成本高,微藻生物质的采收效率低,使得微藻的工业化应用受到了严重的制约。本文以CO2固定和正渗透藻水分离及其污染机制研究为目标,研究微藻在光生物反应器内的气液传递效率和光合效率,开发新型封闭式光生物反应器,提高微藻生物质产量。同时,以正渗透(forward osmosis,FO)膜分离技术为基础,开展FO藻水分离研究,探索了藻水体系中的膜污染因素和机理,为微藻的规模化养殖系统提供技术支撑,主要研究内容和结论如下:(1)针对微藻光生物反应器产量低的问题,开发了新型光内柱式微藻光生物反应器,以能够耐受高浓度CO2的诱变小球藻作为研究对象,从水力学特征、光照强度、微藻生长状况和固碳能力等方面对反应器的特性进行分析。当曝气速率为 0.1 vvm 时,光内柱式光生物反应器(column photobioreactor with internal light column,ILC-CPBR)中的气液传递效率比等体积柱式光生物反应器(column photobioreactor with the same volume,CPBRv)中的气液传递效率高出 24.3%,比等高度柱式光生物反应器(column photobioreactor with the same height,CPBRh)中的气液传递效率高出21.5%。内柱及内置光源的增加提高了反应器内的光暗比从而增强了微藻生长过程中的光照强度。由于气液传递效率增强和光照强度增加的共同作用,ILC-CPBR中的生物质干重比CPBRv中的生物质干重高出82.4%,比CPBRh中的生物质干重高出64.4%,达到1.66 g L-1;ILC-CPBR中的最大固碳速率比CPBRv中的最大固碳速率高出47.7%,比CPBRh中的最大固碳速率高出26.2%。(2)针对正渗透藻水分离膜污染特征的问题,以小球藻和栅藻为实验藻种,探究藻细胞、胞外多聚物(soluble algal products,SAP)、藻液在FO藻水分离过程中的水通量衰减和污染组分特征的差异。藻液中的藻细胞和SAP是引起FO膜污染的主要原因,同时藻细胞和SAP会产生相互作用引起更严重的水通量衰减。在活性层朝向进料液(active layer facing feed solution,AL-FS)模式下,小球藻藻细胞引起的水通量衰减要大于SAP,而在活性层朝向驱动液(active layer facing draw solution,AL-DS)模式下,SAP引起的水通量衰减要大于藻细胞。但对于栅藻,SAP对水通量的影响始终大于藻细胞;在AL-FS模式下,小球藻的藻细胞更容易吸附在TFC膜的活性层上,减少了小球藻SAP在膜上的吸附位点。相比AL-FS模式,Al-DS模式下SAP在TFC膜支撑层上的大量吸附是FO水通量衰减加剧的主要原因。(3)针对正渗透藻水分离膜污染机制的问题,以小球藻SAP为进料液,以NaCl、MgC12和CaC12为驱动液,比较了复合薄膜(thin film composite,TFC)和三醋酸纤维素膜(cellulose triacetate,CTA)在AL-FS和AL-DS两种模式下的水通量变化情况和膜上所积累的污染物特征,并且探究了可能的膜污染机制。研究发现与CTA膜相比,TFC膜表现出更高的水渗透能力,但同时水通量损失也更大,同时SAP更容易吸附在TFC膜上,但吸附物也更容易用物理清洗的方式从膜上洗脱下来,而吸附于CTA膜表面的污染物更具有不可逆性;当CaC12为驱动液时,Ca2+、SAP和TFC膜活性层表面的R-COOH会发生相互作用,从而使滤饼层牢牢地覆盖在活性层之上,而CTA膜表面仅形成球状颗粒物的沉积。当驱动液为NaCl和MgCl2时,TFC膜水通量可以保持在一个较高的水平,具有较强的抗污染性。本论文研究开发了一种新型柱式微藻光生物反应器,提出了微藻SAP对FO膜的潜在污染新机制,为微藻规模化生产和藻水分离提供了理论基础。

关键词： air lift bioreactors   batch   Cordyceps militaris   fed-batch cultivation   Grifola frondosa   Hericium erinaceus   medicinal mushrooms   morphology and rheology   oxygen transfer   stirred tank   submerged cultivation   Trametes versicolor  

摘要： Basidiomycetes of various species and their wide range of pharmaceutically interesting products in the past decades represents one of the most attractive groups of natural products in Asia and North America. Production of mushroom fruit bodies using farming technology is hardly covering the market. Development of comprehensive submerged technologies in stirred tank and air lift bioreactors are the most promising technologies for fast and large-amount cultivation of medicinal mushroom biomass and its pharmaceutically active products. Research in physiology, basic and applied studies in mushroom metabolism, process engineering aspects, and clinical studies in the past two decades represent a large cotribution to the development of this potential, which initiates the development of new drugs and some very attractive over-the-counter human and veterinary remedies. The current article is an overview of the most relevant engineering achievements in submerged cultivation of some medicinal mushrooms-Grifola frondosa, Trametes versicolor, Hericium erinaceus, and Cordyceps militaris-and some other species biomass production in bioreactors.

关键词： 废水处理   厌氧氨氧化微生物燃料电池   基质浓度   脱氮性能   产电性能  

摘要： 厌氧氨氧化微生物燃料电池作为一种新型污水处理技术，可实现脱除氨氮的同时产生电能。本论文主要研究基质条件对厌氧氨氧化微生物燃料电池性能的影响，通过搭建厌氧氨氧化微生物燃料电池反应器，经过39d成功运行了厌氧氨氧化微生物燃料电池，并基于此进一步研究了基质浓度、Fe2+、Ca2+、Mg2+、磷酸盐对厌氧氨氧化微生物燃料电池性能的影响。　　(1)成功启动厌氧氨氧化微生物燃料电池后，通过分析不同基质浓度(NH4+-N和NO2--N)时厌氧氨氧化微生物燃料电池的脱氮性能和功率密度，分析表明:厌氧氨氧化微生物燃料电池的最适NH4+-N浓度为165.4mgN·L-1、NO2--N浓度为173.6mgN·L-1，此时反应器对外最大输出功率密度达到271.2mW·m-3，TN去除速率为824.10mgN·(m3·d)-1。　　(2)厌氧氨氧化微生物燃料电池在最适基质浓度时，考察不同进水Fe2+对厌氧氨氧化微生物燃料电池处理废水的性能影响，结果表明:Fe2+浓度为10.07mg·L-1时，电池脱氮产电性能最佳，电池对外最大输出功率密度为324.9mW·m-3，TN去除速率为987.5mgN·(m3·d)-1。Fe2+浓度在4.78mg·L-1～10.07mg·L-1时，反应器脱氮和产电能力逐渐加强。Fe2+浓度在12.59mg·L-1～15.11mg·L-1时，电池脱氮性能逐渐增强而产电性能基本保持一致，可归因为Fe2+主要用于增加亚铁血红素c的含量，而用于胞外电子传递的Fe2+和NO2-数量基本一致。　　(3)厌氧氨氧化微生物燃料电池在最适基质浓度时，考察不同进水Ca2+对厌氧氨氧化微生物燃料电池处理废水的性能影响，研究发现:Ca2+对厌氧氨氧化微生物燃料电池脱氮性能有显著的影响，而对产电性能没有显著的影响。厌氧氨氧化微生物燃料电池进水Ca2+浓度为108.21mg·L-1～140.7mg·L-1时，考虑由于阳极内Ca2+增加了Anammox菌的强度，减少了Anammox菌团水解的数量，从而加强了反应器脱氮效果。在反应器进水Ca2+浓度大于108.21mg·L-1时，电池对外最大输出功率密度基本保持一致，认为由于Ca2+增加了Anammox菌团的强度，从而减弱了NO2--N胞外传递电子的能力，致使反应器脱氮效果增强而产电效果没有明显的变化。　　(4)厌氧氨氧化微生物燃料电池在最适基质浓度时，考察不同进水Mg2+对厌氧氨氧化微生物燃料电池处理废水时脱氮和产电性能的影响，研究发现:Mg2+浓度能够显著影响厌氧氨氧化微生物燃料电池的脱氮性能，但对厌氧氨氧化微生物燃料电池产电性能影响不大。厌氧氨氧化微生物燃料电池进水Mg2+浓度为19.51mg·L-1～97.85mg·L-1时，Anammox菌活性逐渐增强，表明厌氧氨氧化微生物燃料电池脱氮性能逐渐增强。Mg2+浓度为97.85mg·L-1时，厌氧氨氧化微生物燃料电池脱氮性能最佳，TN去除速率达到974.26mgN·(m3·d)-1。随着进水Mg2+浓度的增加(19.51mg·L-1～97.85mg·L-1)，电池产电能力基本一致，认为由于胞外电子传递的NO2-数量基本一致，致使反应器脱氮效果增强而产电效果没有明显的变化。　　(5)厌氧氨氧化微生物燃料电池在最适基质浓度时，研究了厌氧氨氧化微生物燃料电池在不同磷酸盐浓度下的脱氮和产电性能，实验发现:磷酸盐对厌氧氨氧化微生物燃料电池的脱氮性能和产电性能具有一定的影响。进水PO43-浓度1284.41mg·L-1时，反应器脱氮性能最佳，TN去除速率达到1051.15mgN·(m3·d)-1。厌氧氨氧化微生物燃料电池进水PO43-浓度为18.98mg·L-1～1284.41mg·L-1时，由于磷酸盐降低了细胞外多聚物的产生，刺激了Anammox体脱氢酶活性，反应器脱氮效能逐渐提高。PO43-浓度为1424.91mg·L-1时，由于高浓度的PO43-阻碍了Anammox体基质的传递，从而导致反应器脱氮性能降低。当进水PO43-浓度为1142.03mg·L-1时，厌氧氨氧化微生物燃料电池产电性能最佳，此时电池对外最大输出功率密度为280mW·m-3。

关键词： 曲面混流桨   搅拌式生物反应器   计算流体力学(CFD)   流动特性   结构优化  

摘要： 生物反应器是细胞体外培养的核心装置,在生物医药领域发挥着越来越重要的作用。搅拌式生物反应器具有工艺简单、操作方便、细胞适应性好等特点,是目前使用最广泛的反应器结构。但反应器内部流场比较复杂,无法通过理论计算得到解析解,同时机械搅拌产生的剪切力将对细胞产生损伤作用,因此非常有必要对搅拌反应器内部流动特性进行详细数值模拟研究。本文对底入式生物反应器进行了流动特性模拟,开发了适用于细胞培养环境的曲面混流搅拌桨,并对搅拌桨结构参数进行了优化设计。论文的主要研究工作和取得的成果如下:(1)建立了搅拌式生物反应器模型,采用多重参考系法(MRF)对反应器内的流场进行了数值模拟计算。模拟得到速度场与实验结果进行了比较,发现两者吻合较好,验证了模拟方法的准确性与可行性。比较了Standard k-ε、RNG k-ε和Realizable k-ε三种湍流模型的模拟结果,发现RNG k-ε模型的模拟结果与实验测量值的偏差较其他两种湍流模型大。(2)研究了RT桨、PBT桨、EE桨和B-EE桨四种搅拌桨对生物反应器流动特性的影响。结果表明,采用本文提出的B-EE桨反应器,其平均湍动能最大,剪切率水平较低,兼有良好混合性能和较小剪切率的优点,是细胞培养生物反应器的首选搅拌桨。RT桨反应器内部的流动循环与其他三种差别较大,其流动循环主要分布于邻近反应器筒壁区域,不利于物质的整体混合,所以一般不适用于底入式生物反应器。(3)曲面混流搅拌器主要结构参数包括扇叶宽度、搅拌器外径与反应器内径比和桨叶与搅拌轴的夹角。本文采用三因素三水平正交试验法,分析了曲面混流搅拌桨结构参数对生物反应器流动特性的影响。综合考虑良好混合效果和低剪切率的要求,得到最优的曲面混流搅拌器参数为:搅拌器与轴的夹角60°,扇面宽度90°和搅拌器外径与釜体内径比1/2。(4)研究了搅拌桨转速(150rpm,200rpm,250rpm,300rpm,350rpm和400rpm)对反应器内流动特性的影响。反应器内流体的湍动能、湍动能耗散率和剪切率随着速度的增大而增大。当转速为250rpm时平均剪切率为14.4(1/s),最适合细胞的生长。本文提出的曲面混流桨适用于底入式生物反应器,兼具良好混合性能和低剪切率的特点,对于生物反应搅拌器的开发具有重要的参考价值。后续的研究可围绕激光粒子成像技术(PIV)和激光多普勒测速技术(LDA)等方法进行实验测量。

关键词： Human induced pluripotent stem cells   iPS cells   hiPSCs   differentiation   cardiomyocytes   regenerative medicine   bioreactor suspension culture   Wnt signaling   ascorbate   robust method  

摘要： Human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are promising candidates to treat myocardial infarction and other cardiac diseases. Such treatments require pure cardiomyocytes (CMs) in large quantities. Methods: In the present study we describe an improved protocol for production of hiPSC-CMs in which hiPSCs are first converted into mesodermal cells by stimulation of wingless (Wnt) signaling using CHIR99021, which are then further differentiated into CM progenitors by simultaneous inhibition of porcupine and tankyrase pathways using IWP2 and XAV939 under continuous supplementation of ascorbate during the entire differentiation procedure. Results: The protocol resulted in reproducible generation of >90% cardiac troponin T (TNNT2)-positive cells containing highly organized sarcomeres. In 2D monolayer cultures CM yields amounted to 0.5 million cells per cm 2 growth area, and on average 72 million cells per 100 mL bioreactor suspension culture without continuous perfusion. The differentiation efficiency was hardly affected by the initial seeding density of undifferentiated hiPSCs. Furthermore, batch-to-batch variations were reduced by combinatorial use of ascorbate, IWP2, and XAV939. Conclusion: Combined inhibition of porcupine and tankyrase sub-pathways of Wnt signaling and continuous ascorbate supplementation, enable robust and efficient production of hiPSC-CMs.

关键词： 绵羊促卵泡激素   重组   CHO-K1细胞   生物反应器   生物活性  

摘要： 促卵泡激素FSH是由垂体前叶嗜碱性细胞合成并分泌的一种糖蛋白类促性腺激素,由α亚基和β亚基通过非共价键结合而形成,常用于增进动物的快速繁殖,诱导雌性动物超数排卵。兽用促卵泡激素FSH多数是采用从垂体中提取,人用FSH一般是采用尿源性的FSH,即从绝经期妇女尿液中提取,但是生产成本依旧较高,且纯度无法达到99%。如果进一步提高纯度,成本只会更加昂贵。因此本研究使用重组DNA技术对重组绵羊FSH进行分泌表达并对其进行应用研究。首先对重组绵羊促卵泡激素FSH序列进行设计,构建重组表达质粒pcDNA3.1-FSHβα。构建好的重组表达质粒通过电转染至CHO-K1细胞中,转染后利用G418筛选出单克隆细胞M-FSH-βα-B31A4,单克隆细胞表达重组绵羊FSH的含量达到350 ng/mL。使用5 L生物反应器对单克隆细胞进行培养,培养68 h收集细胞上清液。之后采用分子量为10 kD的膜包对细胞上清液超滤浓缩,得到531ng/mL的重组绵羊促卵泡激素FSHβα。重组绵羊促卵泡激素FSHβα制备完成后,采用多次皮下注射雌鼠的方法进行试验,注射一次后,间隔一天再次进行注射,72 h后对雌鼠进行眼球采血,收集血清进行黄体生成素LH和孕酮Pg的ELISA检测,其含量显著上调。雌鼠处死后解剖取其卵巢,观察卵巢大小并称重,卵巢重量显著增大。综上所述,本研究成功构建合成了重组表达质粒pcNDA3.1-FSHβα,表达质粒成功转染至CHO细胞中,经过筛选获得了单克隆细胞。单克隆细胞表达的重组蛋白经过超滤浓缩,获得了更高浓度的重组绵羊FSH。通过小鼠试验,发现重组绵羊FSH对小鼠具有一定的生物活性,能促进卵巢增大,生殖因子显著上调,为下一步工业化应用奠定了基础。