关键词:
戊型肝炎疫苗
昆虫-杆状病毒表达系统
生物反应器
培养工艺
优化
类病毒颗粒
摘要:
目的 优化昆虫-杆状病毒表达系统培养工艺,进一步提高重组戊型肝炎类病毒颗粒(hepatitis E virus-like particles,HEV-LPs)蛋白表达量,并进行工艺放大及验证。方法 对Sf9昆虫细胞进行无血清悬浮培养,通过摇瓶级联放大,建立7 L生物反应器培养工艺,并对细胞接种重组戊型肝炎杆状病毒时的活细胞密度、培养温度及病毒接种比例等参数进行优化,观察细胞生长状态,分析目的蛋白表达量,对目的蛋白采用SDS-PAGE、Western blot、高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)、透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)检测,综合分析HEV-LPs颗粒形态及蛋白产量,确定适合的重组HEV-LPs培养表达参数,进行连续3批7 L规模重组戊型肝炎疫苗的制备。结果 7 L生物反应器对昆虫细胞最佳培养参数为:搅拌速度90 r/min,pH(6.2±0.1),培养温度27℃,接种重组杆状病毒的细胞密度6.0×10~6 cells/mL,溶氧90%。此时,表达的HEV-LPs目的蛋白相对分子质量约58 000,可与HEV鼠源单克隆抗体特异性结合;最终产量为60~70 mg/L,纯度大于95%;TEM镜下可见球形颗粒,直径约20 nm。应用优化参数制备的HEV-LPs重组蛋白产量稳定、颗粒形态均一。结论 成功优化了重组戊型肝炎疫苗培养表达工艺,并进行了放大工艺的稳定性验证,为重组戊型肝炎疫苗生产工艺的研发奠定了基础。