课程文献中心 更多>>

关键词： 正渗透膜生物反应器   离子交换树脂   盐积累   膜污染   污水回用  

摘要： 正渗透膜生物反应器(Osmosis membrane bioreactor,OMBR)是一种新兴的废水处理和资源化利用技术。然而,盐积累仍然是OMBR技术的主要障碍之一,也是当前关心的热点问题。本文将离子交换树脂(Ion exchange resins,IERs)作为吸附剂,在对盐度控制研究的基础上,构建了IERs-OMBR-膜蒸馏(Membrane distillation,MD)复合系统,通过与传统OMBR-MD系统水通量、污水处理程度、活性污泥特性和膜污染等变化情况对比研究,考察了IERs的加入对OMBR盐积累的缓解作用,同时分析了系统膜污染情况。首先探讨了混合IERs对氯化钠的静态吸附作用。实验结果表明凝胶型强碱性阴离子交换树脂(201×7)和大孔型强酸性阳离子交换树脂(D001)的组合具有较高的除盐率和吸附容量。适宜的静态吸附条件为:阴阳树脂的混合比例为3:1,混合IERs投加量为16 g/L,吸附平衡时间为120 min。阴阳混合IERs分别使用0.7 mol/L Na OH和0.7 mol/L HCl再生五次后除盐效果仍然达到81.35%。201×7和D001分别对Cl和Na吸附过程均符合Langmuir吸附等温模型、准二级动力学和三段式颗粒内扩散模型;FTIR和SEM表征结果表明201×7和D001的吸附过程存在物理和化学吸附。另外,共存离子和有机物对除盐效果具有一定的抑制作用。在对比IERs-OMBR-MD和OMBR-MD两系统处理模拟生活污水的性能实验中,当混合IERs投加量为8g/L时,反应器运行30天后的电导率可保持在6.87 m S/cm,比未添加IERs的传统OMBR-MD反应器的电导率低30%。实验结束时,OMBR-MD系统的水通量(1.135 L/(m·h))与IERs-OMBR-MD系统的水通量(2.675 L/(m·h))相差约58%。两系统对有机物和营养物质具有较高的去除效果,MD出水均可达到《城市污水再生利用城市杂用水水质(GB/T 18920-2020)标准。IERs的加入有效控制了OMBR系统中的盐积累。IERs-OMBR-MD中污泥混合液的MLVSS/MLSS、比好氧呼吸速率均高于OMBR-MD系统,溶解性微生物产物、胞外聚合物和p H值均低于OMBR-MD系统。使用渗透阻力过滤模型对两系统膜污染阻力计算得出,实验运行30天后,IERs-OMBR-MD和OMBR-MD系统膜污染阻力大小分别为65.038×10m和116.039×10m。对污染前后的正渗透(Forward osmosis,FO)膜进行SEM和FTIR表征发现:OMBR-MD系统的FO膜表面覆盖了致密的滤饼层,而IERs-OMBR-MD系统的FO膜表面相对光滑,膜表面结构仍较为清晰;FTIR结果表明,两系统膜表面有机污染物成分主要为蛋白质和多糖,IERs-OMBR-MD系统的FO膜表面多糖、蛋白质和TOC含量分别为32.5 mg/L、30.0 mg/L和81.8 mg/L,OMBR-MD系统中多糖、蛋白质和TOC含量分别为55.0 mg/L、37.5 mg/L和111.3 mg/L;XRD结果表明,膜表面的无机物主要为Na Cl和Ca CO。当TDS在100～400 mg/L时,再生后的混合IERs静态除盐率仍为95%以上。使用SEM观察污染后的IERs发现树脂表面沾满了一层致密的污染物,FTIR结果表明IERs可以吸附少量蛋白质、多糖等有机污染物。

关键词： 微藻   污水深度处理   光生物反应器   城市污水   脱氮除磷  

摘要： 在水体富营养化严重、能源危机与全球气候变暖的背景下,微藻由于其污水净化效率高、油脂可资源化、光合能力强,成为污水深度处理领域重要的研究对象。微藻能够利用污水中的氮、磷和有机碳等营养元素,在实现污水深度净化的同时得到自身生物量的积累,转化为具有经济价值的生物质能源。此外,微藻光合作用时吸收CO2,对温室效应的缓解与碳中和目标的推进具有积极意义。因此,微藻污水深度处理是一种可持续的绿色处理技术。微藻深度处理技术中藻类品种、环境条件及反应装置对污水的高效处理至关重要。针对以上问题,本文选取水处理效果较好的微藻藻种,对比分析除污效能,筛选出优势藻种;并深入优化其培养条件,促进污水中氮磷等营养元素的去除;在此基础上,开发一种浅层藻床反应器用于城市生活污水深度处理,旨在为微藻污水深度处理技术的应用提供依据。主要内容包括以下四个方面:本文对比分析了普通小球藻、蛋白核小球藻、斜生栅藻及水华鱼腥藻四种微藻在模拟二级出水中的污染物去除效果及生长状况。结果表明,普通小球藻对有机碳、磷和氨氮的去除效果最好,最佳出水中COD、TP、NH3-N的浓度分别为11 mg/L、0.34 mg/L和4.1 mg/L,均达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002)中的一级A标准。在此基础上,优化微藻生物反应器的运行条件。结果表明,普通小球藻适宜的生长温度为26～30℃,30℃时处理效果最佳;适宜的光照强度为4000～8000 lux,6000 lux时处理效果最佳;氮磷元素的去除效果与光照时间呈正相关,而COD则相反,光暗比为14 h:10 h时藻细胞生物量积累最多;CO2体积分数为1%时,脱氮除磷效果最佳,过高的CO2浓度会抑制藻细胞生长;初始接种藻密度为1×106～1×107 cells/mL时脱氮除磷效果较好。并且根据以上结果构建了普通小球藻细胞生长动力学模型,描述了温度、光照强度和CO2浓度与普通小球藻生长速率的关系,模型拟合度较高。本文设计开发了一种浅层藻床反应器,主要探究了水深及藻细胞密度对光衰减的影响,得到光衰减模型I=I0exp[-(0.8961OD680+0.19025)·L],由此可以确定当入射光照强度为100000 lux时反应器临界水深约为25 cm。同时,结合开放式与密闭式微藻生物反应器的优点,设计了循环系统、光照系统、温度控制系统及藻水分离系统,使反应器运行条件可控,能够实现前文研究所得的工艺条件。其中,循环系统使CO2气体从反应器底部通入,一方面提供微藻光合作用所需无机碳源,另一方面能够起到垂直方向藻液混合的作用,使藻细胞与光照及营养物质等接触更均匀,减少了额外使用混合装置的能耗。反应器在室外运行,主要利用自然光照,人工光照系统作为补充。因此,相比于密闭式生物反应器浅层藻床反应器的能耗更低。本文利用浅层藻床反应器小试装置进行动态实验,在上述最佳工艺条件下探究水力停留时间对脱氮除磷效果的影响。结果表明,水力停留时间为1～1.5 d时,普通小球藻对实际污水厂二级出水的处理效果最佳。反应器运行至稳定状态时,出水中TP、NH3-N和TN的浓度分别保持在0.1～0.2 mg/L、3.5～4.2 mg/L和5.1～6.5 mg/L,COD浓度保持在10～20mg/L范围内。出水TP和COD浓度分别达到《地表水环境质量标准》(GB 3838-2002)Ⅳ类和Ⅱ类水质标准;NH3-N和TN浓度均达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002)中的一级A标准。同时,对稳定期藻细胞油脂含量进行测定,发现使用实际二沉池污水培养的藻细胞油脂含量为17.8～19.2%,高于BG11培养基中藻细胞油脂含量。结果表明,浅层藻床反应器深度处理收获的藻细胞具有较大的资源化潜能。

关键词： 厌氧动态膜生物反应器   垃圾焚烧渗沥液   导电材料   生物强化技术   直接种间电子传递  

摘要： 厌氧动态膜生物反应器（AnDMBR）将膜分离技术与厌氧生物反应器相结合,可有效去除废水中的有机物,截留悬浮固体（SS）和难降解大分子物质,提高厌氧出水水质。目前AnDMBR常采用不导电多孔材料作为载体处理中低浓度有机废水,关于垃圾焚烧渗沥液等高浓度废水的报道很少。直接种间电子传递（DIET）是厌氧体系中一种更高效的电子传递途径,在厌氧反应器中加入导电材料或功能菌种均可以促进DIET过程,强化废水处理效能,生成更多甲烷。因此,本文通过添加导电材料和功能菌种对处理垃圾焚烧渗沥液的AnDMBR效能进行强化,并解析强化机理。本文首先选用导电碳布与聚酯纤维布分别作为载体材料启动AnDMBRs,研究发现碳布AnDMBR启动更快且运行更加稳定,有机物去除效率更高（95%vs 90%）。碳布缓解了厌氧体系内VFAs的积累,使更多有机物转化为甲烷,提升了厌氧出水水质。Geobacter、Desulfovibrio、Closteidium、Sulfurospirillum和Methanothrix等具有胞外电子传递能力的菌种在碳布表面大量富集,形成电活性滤饼层。碳布表面Geobacter的相对丰度约为23%,其代谢有机物产生的电子,通过导电碳布传递给可进行DIET的Methanothrix产生甲烷。导电碳布可以作为AnDMBR中性能良好的载体材料,可有效加快AnDMBR的启动,提升处理效能。针对垃圾焚烧渗沥液中SS及难降解物质含量高的问题,本研究采用碳布AnDMBR进行处理。结果表明在进水COD为15,000 mg/L时,与聚酯纤维布反应器相比碳布反应器具有更高的COD去除率（96.5%vs 85.5%）和甲烷产量（217 vs 169mmol/d）,碳布AnDMBR的OLR提升了27.8%(5.129 vs 4.014 kg COD/（m3·d）)。AnDMBRs可截留分子量>4k Da的有机物,去除渗沥液中>97%的溶解性有机物（DOM）,截留效能良好。碳布表面富集了更多Syntrophomonas和Methanothrix等参与DIET的菌种,Methanothrix菌种的相对丰度超过76%。碳布表面Methanothrix中参与的DIET过程的mtd、fpo D和hdr（ABC）的转录量更高,Syntrophomonas和Methanothrix菌种利用碳布作为导体进行DIET,通过还原CO2产生甲烷。为了解决碳布AnDMBR处理垃圾焚烧渗沥液时负荷低,抗冲击能力差,滤饼层厚的问题,在碳布AnDMBR内加入颗粒活性炭（GAC）。结果表明,GAC-碳布反应器在进水COD浓度为26,000 mg/L,COD去除率高于90%,OLR提高约20.8%,抗冲击负荷能力更强。GAC随着沼气循环增加了膜表面的剪切力,减缓了TMP的增加及滤饼层的积累。与未添加GAC反应器内厌氧污泥相比,含GAC的污泥电导率更高（13.91 vs 3.34μS/cm）。Syntrophomonas、Desulfovibrio等电活性微生物,在GAC反应器悬浮污泥中富集,相对丰度高于载体表面污泥（12.5%vs 9.8%）,Methanothrix菌种在GAC-碳布反应器悬浮污泥中的相对丰度约为78%。GAC的添加进一步促进厌氧微生物间的DIET,强化渗沥液处理中互营代谢产甲烷过程。为进一步提高AnDMBR的耐受负荷并促进产甲烷过程,采用生物强化技术向碳布AnDMBR及GAC-碳布AnDMBR中投加功能菌种Geobacter。结果表明,同时添加Geobacter/GAC的反应器处理效果最好,OLR提高了120%(5.575 vs 12.265kg COD/（m3·d）),进水COD浓度为50,000 mg/L时,该反应器COD去除率高达95%。厌氧出水中芳香结构及类富里酸等难降解有机物含量显著降低。Geobacter/GAC强化体系中Geobacter菌种迅速增长繁殖,相对丰度超过60%,其中高盐环境耐受更好的Geobacter anodireducens成为优势菌种。在高负荷下更稳定且可与Geobacter进行DIET的Methanosarcina菌种相对丰度高于60%。向厌氧体系中添加Geobacter菌种可有效促进体系中DIET过程,提升垃圾焚烧渗沥液厌氧产甲烷效能。

关键词： 厌氧膜生物反应器   碳基介质   膜污染控制   厌氧产甲烷   低温  

摘要： 传统污水处理过程能耗高、碳排量大,通过将厌氧生物处理与膜分离相结合,厌氧膜生物反应器(anaerobic membrane bioreactor,An MBR)可高效去除污水中的有机物并以甲烷的形式回收再利用,降低污水处理能耗与碳排量,助力实现“双碳”目标。然而,An MBR处理市政污水工艺特性研究尚不充分,膜污染技术瓶颈尚未攻克,低温下高效稳定运行难题仍需妥善解决。基于此,本课题构建了兼具能源回收和膜污染控制强化功能的气提浸没式An MBR污水处理系统,研究了系统的工艺性能、膜污染特性及其强化控制、以及低温条件下的处理效能提升技术原理。主要研究成果如下:(1)研究了An MBR处理市政污水的工艺性能,阐明了微生物带代谢产物及微生物群落特征。室温条件下,HRT在3.2?24.0 h范围内An MBR均能高效去除COD,进水中超过77.5%的COD转化为甲烷。污泥中产甲烷古菌/细菌比值与固体停留时间(solids retention time,SRT)显著负相关;不同粒径颗粒中微生物群落组成差异显著,产甲烷古菌在粒径≥10μm的颗粒中丰度较高,而固氮弧菌(Azovibrio)、脱硫弧菌(Desulfovibrio)和互营杆菌(Syntrophobacter)属等膜污染潜力高的细菌是粒径<10μm颗粒中的优势菌。(2)揭示了膜表面泥饼层与凝胶层的物化生化特性与空间构造,阐明了凝胶层形成是膜表面污染的重要成因。凝胶层与泥饼层过滤阻力相当,但凝胶层污染物过滤比阻更高。慢速污染阶段,多糖和蛋白质黏附在膜表面形成多孔网络结构,污泥混合液小颗粒(<10μm)中的微生物填充于网络孔道,形成光滑致密、富含微生物的网络状凝胶层。随着污染物积累,触发快速污染,此时抽吸力增大,加速了大颗粒在膜表面无序沉积,含有丰富胞外蛋白质的粗糙泥饼层快速形成。(3)解析了投加PAC对污泥混合液及膜表面污染物的影响特性,阐明了PAC长效缓解膜表面污染的作用机理。一方面,PAC通过强化水力扰动导致大颗粒解体,污泥絮体胞外聚合物含量降低,电负性增加,膜污染潜力减小。另一方面,PAC通过生物固定与摩擦剪切抑制了常见膜污染微生物向膜表面富集及生物固体在膜表面的沉积。在两种方式的共同作用下,污染物在膜表面黏附-沉积得到有效控制,膜表面污染得到缓解。(4)研究了低温下投加生物炭对An MBR处理效能的提升作用,揭示了生物炭同步强化产甲烷和控制膜污染的作用机理。温度低至10°C时COD去除效率低至60%,膜过滤性能严重恶化。投加生物炭强化了氢营养型产甲烷菌的优势地位,并通过在生物炭表面富集电活性发酵细菌提升厌氧中间代谢产物乙酸和丙酸转化为甲烷过程微生物种间电子传递活性,强化了微生物抵抗低温的能力。与此同时,生物炭通过吸附疏水性SMP与摩擦剪切膜表面改善污泥过滤性能、缓解污染物在膜表面沉积,并通过生物固定减少常见膜污染微生物与膜表面接触,有效缓解膜污染,解决了低温不利条件下An MBR高效运行技术难题。

关键词： Neu5Ac   磷酸烯醇式丙酮酸   大肠杆菌   代谢工程   生物反应器  

摘要： N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)是一种重要的功能性糖,由于其重要的生理功能,被广泛用于食品、医药和其他领域,需求不断上升。目前的生产方法存在一些问题难以解决,如天然产物提取法原料昂贵、化学法分离过程复杂、酶法合成成本高、全细胞催化法操作繁琐等,不利于Neu5Ac的大规模工业化生产。利用代谢工程手段建立稳定、高效的N-乙酰神经氨酸发酵生产体系,是进一步拓展N-乙酰神经氨酸市场的需求。本研究以实验室前期构建的一株N-乙酰神经氨酸生产菌Escherichia coli NEU-2为出发菌株,从多方面增强前体物磷酸式烯醇式丙酮酸(PEP)的供应,获得了一株N-乙酰神经氨酸高产菌株。主要研究内容如下:(1)强化非PTS系统的葡萄糖摄取效率。在NEU-2的基础上过表达大肠杆菌自身的glk基因,获得菌株NEU-3。摇瓶发酵结果显示,NEU-3摄取葡萄糖的速率和原始PTS系统菌株NEU-0相差无几,且Neu5Ac产量比NEU-2提高了127.88%,达到11.28 g/L。(2)增强中心碳代谢过程中的PEP合成。在NEU-3中单独或组合过表达pps、pck基因,摇瓶发酵结果显示,同时过表达pps、pck基因对提升单位菌体Neu5Ac产量有正向作用。(3)利用弱启动子微调丙酮酸激酶的表达。将菌株NEU-3的丙酮酸激酶编码基因pyk F的天然启动子分别替换成弱启动子BBa＿J23103、BBa＿J23109和BBa＿J23116,得到NEU-8、NEU-9、NEU-10。此外,分别敲除菌株NEU-3的pyk F、pyk A基因用作对照。最终,敲除pyk A的菌株NEU-12以其生产和生长的优势,作为其中微调丙酮酸激酶效果最好的菌株。摇瓶发酵结果显示,NEU-12的Neu5Ac产量增长了18.46%,细胞生长未受到明显损害。(4)为减少发酵过程中的乙酸积累,本研究从敲除乙酸合成相关基因pox B、ack A和过表达乙酸利用基因acs两种角度出发,以NEU-12为出发菌构建了一系列工程菌。摇瓶发酵结果显示,敲除pox B基因和ack A基因的菌株在发酵过程中乙酸的积累量显著低于对照菌。(5)重组菌株NEU-12经摇瓶验证有较好的发酵性能,使用5 L发酵罐对其分批补料发酵培养。发酵结果显示,菌株NEU-12在5 L发酵罐中发酵40 h,Neu5Ac产量可达27.41 g/L,产量与生产强度超过目前报道的大肠杆菌中最高值。本研究针对大肠杆菌Neu5Ac合成过程中,前体物PEP供应不足限制目标产物合成效率提升的瓶颈问题,使用代谢工程策略对Neu5Ac生产菌进行合理的改造,最终获得了一株能够高效率合成Neu5Ac的大肠杆菌工程菌,产量和生产强度达到目前报道的大肠杆菌中的最高值。

关键词： 过一硫酸盐   四环素   FeS   三聚氰胺海绵   废水处理  

摘要： 近年来,药品和个人护理用品(Pharmaceuticals and Personal Care Products,PPCPs)由于其大量生产、广泛使用和潜在的环境危害,目前已经成为一类新兴污染物(Emerging Contaminants),其导致的环境污染和危害受到了广泛的关注。以典型抗生素盐酸四环素(Tetracycline hydrochloride,TC)为例,TC在我国多个省份的河流湖泊等环境水体中均有检出。基于活化过硫酸盐产生硫酸根自由基(SO)的新型高级氧化技术,因其氧化剂稳定性好、氧化能力强、反应不受p H影响等优点,在难降解有机污染物的去除方面获得广泛的研究。因此,本研究首先采用了三维多孔结构、孔隙率高、同时具有良好的稳定性和吸附特性的三聚氰胺海绵(Melamine sponge,MS)为载体,通过原位合成法制备了纳米硫化亚铁-三聚氰胺海绵(FeS@MS);通过一系列表征方法对FeS@MS进行了分析;其次,以TC为目标污染物,开展了FeS@MS+PMS和FeS@MS+PMS联合柱式生物反应器两个体系降解TC的研究。最后,探讨了FeS@MS对柱式生物反应器系统稳定性的影响,主要结果如下:(1)TC在FeS@MS+PMS体系中去除率达到95.7%。在NO,SO,和Cl的存在的TC溶液当中TC的去除率略有下降,而HPO对激活PMS降解TC具有一定的促进作用。SO、·OH、O和·O多种活性物种主要在FeS@MS上产生。表面结合的Fe和S在活化PMS过程中作为电子供体,同时海绵起到了一定的保护作用并且能够有效控制Fe的缓慢释放。(2)在FeS@MS+PMS-联合柱式生物反应器体系中,TC的降解率为96.8%,矿化率可达到68.2%。该体系中氧化剂的用量、p H、阴离子和HA对TC的降解影响较小。柱式生物反应器连续运行60天后,发现FeS@MS+PMS促进了柱式生物反应器中生物降解作用。

关键词： 微藻   扩大培养   光生物反应器   中试   污水处理   生物质  

摘要： 微藻具有独特的优势和潜力,在诸多领域中应用广泛,近年来关于微藻的研究备受青睐。目前的研究大致可分为上游、中游和下游三个环节,其中位于中游的规模化培养,直接影响微藻的产量和质量,因此选择合适的生物反应器是微藻产业化的关键。同时微藻规模化培养结合废水处理,既节约了培养成本,又可以实现废物利用,推动了生物能源生产及废水循环利用的有机耦合,一举而多得,是近年来的应用研究热点。本论文以本课题组预先筛选得到的一株优势藻株栅藻YZL17为主要研究对象,分别于室内和户外环境下,进行了不同规模的扩大培养研究,并考察了该藻对市政污水污染物的去除效果和生物质生产能力。主要结果如下:1.设计并建立了2.5 L鼓泡式光生物反应器。在该反应器中进行基础培养,并与锥形瓶培养栅藻YZL17的生物量及产率比较,分别提高了15.0%和22.0%。通过研究光照、p H及氮浓度等因素对反应器中栅藻YZL17生长和油脂积累效果的影响,结果表明光照强度在180μmol/(m·s)时,有利于藻细胞生长和油脂积累,而光照强度为30μmol/(m·s)或300μmol/(m·s)时,藻细胞生长和油脂积累均受到限制;利用CO通入量调节p H值为7时,培养结束藻细胞生物量和油脂含量最佳(生物量为1.78 g/L,油脂含量占干重的26.5%),分别是自然培养(不控制p H)时的1.71倍和1.37倍;适度的氮浓度限制有利于藻细胞油脂积累,当初始硝酸钠浓度为0.1 g/L,培养结束藻细胞油脂含量高达32.5%,是初始硝酸钠浓度为1.5 g/L培养时的1.23倍。2.分别设计并建立了30 L平板式光生物反应器、30 L柱式光生物反应器以及1.8m跑道池,安装在中试玻璃房内,在半自然环境条件下进行栅藻YZL17中试规模培养,结果表明:栅藻YZL17在平板式光生物反应器中生长效果较好,培养结束时其生物量和油脂含量分别是跑道池培养的1.46倍和1.21倍;栅藻YZL17在硝酸钠、尿素和氯化铵三种不同氮源的利用上更趋向于硝态氮和有机氮,其中硝酸钠为氮源时,培养结束藻细胞生物量分别是尿素和氯化铵为氮源时的1.07倍和1.71倍;栅藻YZL17在夏季(8月份)培养时,培养结束后藻细胞生物量和油脂含量分别是冬季(12月份)培养时的1.69倍和1.14倍。在冬季培养过程中,温度是影响藻细胞生长的主要因素,在对冬季进行温度控制后,藻细胞生长速率提高,培养结束其生物量和油脂含量是冬季不控温处理的1.30倍和1.44倍。3.利用栅藻YZL17分别对市政污水处理工艺中一级处理出水和二级处理出水进行了处理,培养前三天内,藻细胞在二级出水中生长速率更快,其生物量产率是一级出水中藻细胞的1.14倍;而在培养后期藻细胞在二级出水中生长速率下降,培养结束后,一级出水中藻细胞生物量为1.09 g/L,二级出水中藻细胞生物量为0.99 g/L。培养周期内,栅藻YZL17对两种污水中总氮的去除率为100%,对一级出水中总磷的去除率为93.8%,对二级出水中总磷的去除率为100%;经一级出水和二级出水培养后栅藻YZL17的脂肪酸成分以C16和C18脂肪酸为主,分别占总脂肪酸含量的92.6%和95.6%,适合生产生物柴油。

关键词： 生物反应器   计算流体动力学   微载体   动物细胞培养  

摘要： 随着细胞疗法,基因疗法等个性化治疗技术的发展,市场对微小型生物反应器的需求将持续增加。目前我国细胞反应器相关研发,尤其是微型反应器方面较为落后,缺少自主创新。本论文开发了一种置于翘板摇床上实现波浪式振荡的微型细胞反应器,其内放置多个一次性培养瓶,可实现基于微载体的动物细胞高通量悬浮培养。课题围绕细胞反应器的设计、性能分析、可用性验证以及应用四方面进行,主要研究内容和结论如下:(1)微型细胞反应器软、硬件系统开发。基于3D打印技术和开源硬件Arduino、开源软件工具C++,Python等搭建了微型反应器原型机系统,包括自定义控制逻辑,基于网络技术的人机交互界面,用于在线和远程监控反应器气速、温度、湿度、CO浓度、培养基中溶氧浓度等基本环境参数。其中,反应器内的湿度可以维持在95%以上,CO浓度在0～10%范围内控制精度±0.5%,温度在36～38℃范围内控制精度±0.2℃,溶氧饱和度在0～100%范围内精度±2%。(2)微型细胞反应器性能表征。以T25培养瓶为培养容器,系统地研究了不同操作条件下的反应器的混合、传质性能和流体力学特性。结果表明,提高振荡转速可以显著降低混合时间并提高传质速率,从30 rpm到80 rpm,混合时间由数十分钟减少至1分钟以内,表观传质系数可达20～30 h,能够满足高密度培养的要求;培养瓶对称轴与翘板摇床旋转轴平行时,培养瓶的摆放位置对混合与传质无明显影响,但当两个轴成45度角时,同转速下混合时间明显缩短;计算流体力学(CFD)模拟显示不同转速下培养瓶的剪切应力和能量耗散率在时间与空间上的分布极不均匀。(3)微型细胞反应器的验证。使用自制的经铁离子修饰的Cytodex1微载体在20～80rpm转速范围进行了常用模式细胞CHO-K1细胞、HEK293细胞以及用于细胞培养肉生产的猪骨骼肌卫星细胞微载体的悬浮培养。三种细胞在转速为60 rpm、80 rpm时空球率较低,转速为40 rpm和60 rpm时细胞培养6天后的回收量较高。CHO-K1细胞和HEK293细胞密度能到达10 cell·m L,猪骨骼肌卫星细胞密度可到达5×10 cell·m L。对从微载体上回收的猪骨骼肌卫星细胞进行了特异性免疫荧光鉴定,细胞依旧有成肌分化能力并且与普通贴壁培养的细胞无明显差别。(4)微型细胞反应器的应用。使用本课题所开发的细胞反应器探索细胞保护剂Pluronic F-68浓度的影响。猪骨骼肌卫星细胞的微载体悬浮培养在保护剂浓度为0.4 g·L和0.8 g·L情况下会减轻剪切作用,相对促进细胞增殖,保护剂添加量应不超过1.0 g·L。利用细胞反应器进行了不同溶氧浓度条件的缩小模型探索,结果显示猪骨骼肌卫星细胞在液相溶氧70%条件下仍可较为正常贴附微载体,但是细胞生长增殖速度远小于高溶氧时微载体悬浮培养,溶氧50%条件下,正常贴附较为困难。

关键词： 膜生物反应器   膜污染   生物泡沫   热力学分析   膨胀污泥   丝状菌  

摘要： 近年来,面对日益严重的水资源短缺情况和更严格的污水排放标准压力,具有水处理效果好、占地面积小、处理效率高、污泥剩余产量低等优势的膜生物反应器（Membrane bioreactor,MBR）在废水资源化与水资源回收应用领域得到了大量的关注。相比于传统的活性污泥法（Conventional activated sludge,CAS）,MBR技术是一项结合了活性污泥工艺和高效膜分离技术各自在污水处理中优势的新技术。尽管MBR技术具有诸多优势,但仍然受膜污染的制约,实际发展面临严重的阻碍。为此需要开展关于膜污染的机理研究,以提出有效的污染防治措施。本研究通过在实验室条件下,启动并运行一台浸没式膜生物反应器,旨在通过观察MBR运行,测定非典型工况下MBR内的污泥性质,以探究污泥性质变化与膜污染之间的联系,并且为实际运用情况下MBR的对应膜污染提供控制策略。首先,针对在MBR中出现的生物泡沫污染行为,探究生物泡沫与膜污染之间的相互联系,并通过Extended-Derjiaguin-Verwey-Overbeek（XDLVO）界面热力学理论与Flory-Huggins理论,解释了泡沫污染物的高黏附及高过滤阻力行为。同时研究了膨胀污泥在MBR运行中所产生的膜污染现象,进而揭示滤饼层和凝胶层造成污染的内在机理,为相关的膜污染研究提供了全新的热力学解释。最后,根据研究膜清洗状况下次氯酸钠（NaClO）对典型污染物（牛血清蛋白BSA）的作用,以探究蛋白质类污染物的空间结构变化对以凝胶层为主的膜污染的影响。主要研究结果如下:（1）通过在细曝气及粗曝气状态下分别运行MBR两个周期,研究发现细曝气模式下MBR容易产生大量生物泡沫,并且在发泡阶段,污染物具有极高的比过滤阻力（Specific filtration resistance,SFR）和对膜表面很强的粘附能力。化学测定表明,生物泡沫样本中的蛋白质和多糖分别是污泥上清液样本的6.4倍和5.4倍,这表明生物泡沫阶段的污泥系统可以产生大量这类污染物。实验结果表明,泡沫污染物与凝胶层过滤过程有关,运用Flory-Huggins理论描述凝胶过滤过程中的化学势变化以解释生物泡沫极高的SFR。XDLVO理论分析表明,泡沫污染物与膜表面之间具有较高的相互作用能,从而产生了较强的粘附能力。最后,通过16S rDNA基因测序证实污泥种群中部分起泡菌和丝状菌可能是产生泡沫污染物的主要原因,这为泡沫污染的潜在生物机制提供了理论支持。该研究为MBR中生物泡沫污染的机理研究提供了新的解释与依据。（2）记录并比较了正常污泥与膨胀污泥两个时期的MBR运行状态与膜污染现象。研究发现膨胀污泥比正常污泥更容易黏附在膜组件表面,具有更高的过滤潜能、较低的脱水性与高粘度,将会引起更加严重的膜污染。一系列的表征测定表明膨胀污泥形成的小粒径污泥作为污染层骨架导致滤饼层更加密实,提高了过滤过程中的过滤阻力。膨胀污泥中存在大量的丝状菌,与滤饼层污泥颗粒之间相互缠绕叠加,进一步加重了膜污染。并且,膨胀污泥所产生的滤饼层中含有大量的胞外多聚物（Extracellular polymeric substances,EPS）（其主要成分为蛋白质与多糖）与凝胶层的形成有关。研究发现这类污染物是由于滤饼层形成后底部氧气不足,膨胀污泥细胞裂解所释放的。16S rDNA技术进一步表明,此时膨胀污泥具有较低的细菌种群丰度及活性。最后,本研究运用FloryHuggins理论与XDLVO理论,从热力学角度解释了膨胀污泥形成的凝胶层所造成的高过滤阻力以及与膜之间具有强大的黏附作用的原因。这项研究中为MBR中膨胀污泥的污染行为提供了新的机理见解。（3）为探究膜清洗机理,本文研究了在不同酸碱条件下次氯酸钠（NaClO）的添加对以牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin,BSA）为模型物质污染物的去除效果。测定发现,在酸性条件下,NaClO的加入会加重膜污染行为;碱性条件下,短时间（30min）反应下可以减轻膜污染。进行表征可知,NaClO的加入会影响BSA的蛋白质二级结构,α-helix与β-sheet的含量变化与膜污染之间有一定的联系。β-sheet所含有的分子间氢键提高了凝胶层的均质性,导致膜污染进一步加重。并且通过Flory-Huggins晶格理论解释了由蛋白质聚合物分子骨架构成的凝胶层高过滤阻力现象的原因。本研究可知,膜清洗过程中NaClO会破坏蛋白质污染物结构,进而加重/减轻膜污染。这为后续开展膜清洗相关的研究提供了理论依据与指引方向。

关键词： 片状载体   生物反应器   脊髓灰质炎病毒   灭活   过滤层析  

摘要： 片状载体生物反应器大规模培养技术是疫苗大规模制备的核心技术之一,也是生物技术药物生产最关键和最具挑战性的技术。Vero细胞生物反应器片状载体大规模培养生产技术的建立以及后期纯化处理工艺对多种病毒疫苗的产业化运行具有重要意义,并对未来新型疫苗研制奠定基础。 本课题通过片状载体生物反应器培养的方法,完成了Vero细胞的50L消化放大培养工艺,并以此为基质完成了脊灰病毒Sabin株Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型的培养。建立了稳定的疫苗下游处理工艺,包括过滤澄清、超滤浓缩、纯化灭活,以及制剂处方工艺,从而达到99%以上疫苗蛋白去除率。对各级工艺的样品进行检测分析,建立了完整的质量评估体系,疫苗成品免疫原性和安全性良好,各项指标均达到规定要求。主要研究结果如下: (1)Sabin株脊髓灰质炎病毒的50L片状载体生物反应器培养工艺研究。选取不同片状载体厂家,以及细胞接种密度,可知以Fibra-Cel片状载体接种1.5×10～6/ml Vero细胞,培养7天细胞密度可增长到1.7×10～7/ml,达到细胞接毒条件且Vero细胞生长状态良好。在单因素试验基础上通过正交设计试验对病毒培养工艺条件进行优化。结果表明:以病毒滴度、产毒效率为指标病毒培养的最佳条件为30g/L载体装量,病毒接种0.01MOI,病毒培养时间96h,病毒培养温度32℃。在此优化条件下,Sabin株脊髓灰质炎II型病毒滴度可达到8.8,D抗原含量143.3DU/ml,产毒效率为95.5。 (2)Sabin株脊髓灰质炎病毒纯化、灭活工艺的研究。以蛋白含量、D抗原含量和比活为指标,通过比较不同体系过滤系统,选取POD一次性深层过滤系统进行澄清工艺;对超滤膜包截留分子量、浓缩倍数进行优化,选取100KD超滤膜包进行40～50倍浓缩,抗原回收率最高;对琼脂糖凝胶介质分子筛层析纯化进行优化分析,选取Sepharose CL-6B为填料,上样量在3%～5%之间,0.02%TWEEN80的10m M PBS缓冲液作为洗脱液,杂蛋白去除率在80%以上,D抗原回收率均在83%以上;最后对灭活剂进行了选取并对灭活条件进行了优化,选取甲醛为灭活剂,纯化液在p H7.0条件下,37℃灭活6天结束,此条件下病毒多为单个病毒颗粒,少量形成小的病毒聚集颗粒。 (3)Sabin株脊灰疫苗有效性及安全性分析。构建了I型/II型/III型制剂处方,确定D抗原最优配比为15/45/45 DU/剂。对蛋白含量的检测进行了方法学优化验证,进行了疫苗生产的稳定性研究。本课题研究表明:各批次检测结果具有良好的均一性和稳定性。说明制备的工艺稳定,疫苗的有效性及安全性良好。 综上,我们建立了以Vero细胞为基质,采用片状载体进行生物反应器大规模培养的技术,使用该技术制备的Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗符合新型疫苗研制的相关要求,可用于大规模脊灰疫苗的生产。