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关键词： 生物脱氮   膜曝气生物反应器   AME-D   气体碳源   载体强化  

摘要： 膜曝气生物反应器(MBfR)是一种膜曝气法水处理技术,具有无泡曝气、气体利用率高、异向传质等特点。目前,MBfR已被应用于好氧甲烷氧化耦合反硝化(AME-D)过程,以甲烷作为气体碳源,通过好氧甲烷氧化生成中间产物为反硝化过程提供碳源。然而,甲烷基质MBfR存在脱氮效能低、生物量不稳定等问题,制约了其实际应用。本文以甲烷基质MBfR为研究对象,通过在中空纤维膜上负载柱状聚氨酯海绵作为载体,研究膜表面载体强化手段对生物膜性能与系统脱氮效能的强化作用;对载体强化型MBfR在连续流运行下的效能进行研究,分析生物膜形成过程、微生物群落变化与水力冲击对反应器运行效能的影响,确定最优的载体强化方案;研究了载体强化型MBfR中间产物代谢行为,以及功能微生物群落结构变化特征,分析了载体强化型MBfR脱氮效能提升的内在机制。研究了膜表面载体强化手段对MBfR脱氮效能的影响。对比不同载体强化型MBfR内生物膜性状与反应器运行效能,分析了不同载体强化手段对生物膜以及脱氮效能的强化作用。结果表明:载体强化型MBfR生物量及脱氮效明显提高,在孔隙密度为50 ppi、60 ppi载体条件下,生物量最大分别提升350%、600%;硝态氮去除速率分别提升101.5%、13.8%;ΔC/ΔN分别降低62.9%、59.6%。研究了强化型MBfR连续流运行下的处理效能行为与影响因素。通过对生物膜形成过程的分析、运行效能的研究,确定了载体强化手段与脱氮效能提升的相关性。50 ppi密度载体提高生物富集速度,促进疏松多孔的生物膜形成,ΔC/ΔN是对照组的0.27倍,γ-变形菌纲与β-变形菌纲丰度最大提升38.3%、22.6%,优化功能菌群丰度,能够有效抵抗水力冲击负荷。分析了强化型MBfR脱氮效能提升的内在机制。通过解析中间产物代谢规律,研究了载体强化手段对功能微生物的种类与丰度的影响;对酶活性、功能基因丰度进行分析,探究强化型反应器效能提升的微生物机制。载体的存在通过调节功能微生物丰度,促使优质中间产物释放,提升功能基因绝对丰度与酶活性,提升好氧甲烷氧化耦合反硝化效能。载体强化手段能够实现甲烷基质MBfR污染物的高效降解与气体碳源的高效利用,对甲烷基质MBfR技术的工程应用与推广具有重要意义。

关键词： 沼液   微藻   生物膜   光生物反应器   氮磷脱除  

摘要： 随着我国畜禽养殖业的快速发展,实现畜禽粪污资源化运用的沼气工程也越来越加普及,但畜禽粪污经厌氧发酵制沼气后仍会残留大量的沼液,沼液属于高浓度有机废水,具有高氨氮、高浊度等特点。传统的废水处理工艺不能有效的净化沼液使其达到排放标准,但微藻可以消耗沼液中的氮磷等元素满足自身生长,同时生成油脂等生物质能源和其他高附加值的产物。因此,将微藻培养和沼液净化相结合,能够实现对沼液资源化利用并获得高价值生物质产物,具有非常光明的应用前景。本文以微藻净化沼液为主要研究目标。从微藻净化沼液瓶颈问题入手,通过改变沼液稀释比例逐步提高其氨氮浓度梯度,进而驯化微藻使其获得高氨氮耐受性。然后基于新获得的微藻藻种,提出了阶梯式微藻生物膜反应器来克服沼液高浊度的限制和解决藻水分离高能耗的难题,研究了不同基底材料对微藻成膜特性的影响,明晰了光照强度和流量对沼液氮磷等污染物脱除效率的影响。最后构建了微藻连续处理沼液的串联系统,实现了阶梯式生物膜反应器处理沼液的连续性和稳定性,并探究了长期运行过程中沼液污染物脱除机理和达标排放调控方法。主要结果如下:(1)小球藻经沼液梯度驯化后,微藻细胞平均直径较驯化前提高了40.7%。随着氨氮浓度的逐步提高,氨氮的去除速率从27.98 mg/L/d提高至82.66 mg/L/d,这表明微藻对沼液的氨氮耐受性是逐步提高。微藻生长过程中存在对磷的“奢侈吸收”现象,经过驯化后的微藻对总磷的脱除率在60%沼液和80%沼液实验中达到了100%。在开放式跑道池中,驯化后的微藻在含有678 mg/L的氨氮的沼液能够实现正常生长,且沼液中氨氮和总磷的脱除率均达到了100%,证实了驯化后的微藻能够忍耐高氨氮且具有优异的氮磷脱除性能。(2)确定适合微藻成膜的基底时,以棉布为基底的反应器运行7天后生物膜产率达7.66±0.184 g/m/d,是其它四种材料(珊瑚绒、工业滤布、过滤棉和麻布)的1.90～2.85倍,吸水率达3.2±0.17 g/g,膜HRT为0.85±0.050 h/m,氨氮和总磷脱除率达100%需要5天和3天,因此综合比较来看,选择棉布作为成膜基底最为合适。在研究光强和流量对微藻生物膜反应器沼液净化效果影响的实验中,发现光强为15000Lux时微藻生物膜产率最大,达7.02±0.044 g/m/d,且沼液中的氮磷脱除率均达到了100%。在流动挂膜的初始阶段,低流量(10 mL/min)工况下底部悬浮液中的微藻全部附着在生物膜基底上需要1天,而在中流量(15ml/min)工况和高流量(20 ml/min)工况下需要2天,表明基底挂膜的生物量与流量无关,但挂膜的时间会随流量的增加而增加。反应器内微藻成膜达到稳定状态后,低流量(10 ml/min)工况下微藻生物膜密度沿着水流方向从初始位置的70.03 g/m下降到终点位置的23.73 g/m,而高流量(20 ml/min)工况中则从63.41g/m下降到12.33 g/m,说明流动剪切力的作用会使得微藻生物膜密度沿水流方向呈下降趋势,且流量越大的情况下生物量下降越明显。值得注意的是不同流量工况下,氨氮和总磷的去除率都达到了100%,高流量工况中氨氮脱除周期更短,而低流量工况中总磷脱除周期更短。(3)采用序批式操作方法长期运行微藻生物膜反应器的实验中,经过三个培养周期(21天),微藻生物膜密度达到了52 g/m,并在其后14天的连续运行中保持了稳定。在五次沼液批次净化过程中,沼液中总磷的脱除率均达100%,氨氮脱除率最低达89.3%,氮磷出口浓度均满足国家颁布的《畜禽养殖业污染物排放标准》(GB18596-2001)。生物膜密度达到稳定后反应器出水口处于悬浮态的微藻浓度为0 mg/L,证明了反应器内生物膜结构的稳定,微藻和沼液通过成膜的方式实现了有效的分离。在串联系统中,1号和2号反应器中微藻Fv/Fm值稳定在0.56,3号反应器中微藻Fv/Fm值稳定在0.66,证明了连续处理沼液过程中微藻光合潜力并未受到影响。最终串联系统出口处的氨氮和总磷脱除率均达到了100%,实现了沼液单次循环流过反应器即可将氮磷脱除完全的目标。

关键词： 好氧颗粒污泥   蛋白质组学分析   胞外聚合物   微生物群落   蛋白质功能  

摘要： 好氧颗粒污泥和膜生物反应器结合的技术在提高出水水质、减小占地面积、减轻膜污染方面有着良好的表现。本研究对稳定运行的连续流好氧颗粒污泥-膜生物反应器进行研究,利用蛋白质组学技术等讨论溶解氧变化对好氧颗粒污泥稳定性的影响。本研究使用人工模拟废水,实验周期90天,按溶解氧浓度梯度变化分为五个阶段,使溶解氧浓度先降低再升高,并进行相应地检测分析。在实验过程中连续监测反应器内溶解氧和膜组件跨膜压差变化,利用光学显微镜观察污泥变化,每天测定进出水污染物浓度,每隔5-8天测定污泥的胞外聚合物含量,用激光粒度仪测定污泥粒径大小,用高通量测序技术分析微生物种群变化情况,用蛋白质组学技术分析胞外聚合物中蛋白质功能变化,从而分析好氧颗粒污泥稳定性的变化。好氧颗粒污泥-膜生物反应器在90天的实验周期中污染物去除效率一直很高,化学需氧量(COD)的平均去除率为94.08%,反应器的脱氮能力也较为良好,总氮的平均去除率为90.8%,在整个实验过程中反应器的去除效果都比较稳定。在反应器经历溶解氧浓度变化过程中颗粒污泥的粒径也随之变化,在溶解氧保持在1.5 mg/L时颗粒污泥的在700μm左右,而溶解氧降至0-0.5 mg/L时,粒径最小达到324μm。颗粒污泥胞外聚合物中多糖和蛋白质含量也随着溶解氧浓度变化而发生了变化,其中蛋白质含量的变化呈现一定的规律,对于曝气区的紧密型胞外聚合物(TB-EPS),第一阶段和第二阶段的紧密型胞外聚合物中的蛋白质(TB-PN)浓度平均值为98.45mg/g MLSS,第三阶段的TB-PN浓度平均值降至68.21 mg/g MLSS,而第四阶段和第五阶段,它增加到了138.46 mg/g MLSS。高通量测序结果表明溶解氧变化导致了微生物群落的演替,Thiothrix的含量最多,腐螺旋菌属含量增加导致胞外聚合物中蛋白质含量降低,蛋白质含量降低使颗粒污泥结构变松散,并进一步促使颗粒污泥解体。球衣菌属等硝化和反硝化菌的变化也解释了胞外聚合物中蛋白质含量变化的结果。蛋白质组学结果表明在非常低的溶解氧浓度(0-0.5 mg/L)下,霍式肠杆菌产生的蛋白质标签(protein tag)这种蛋白功能显着富集,使得颗粒污泥中的结构蛋白发生降解,这是好氧颗粒污泥(AGS)结构被破坏的重要原因。此外,蛋白质组学分析的结果还表明,参与TB-EPS胞外结构和核结构的功能蛋白数量为0,这表明TB-EPS中的蛋白质主要参与各种功能性作用,但不参与结构组成。综上所述本课题在膜生物反应器中设置了一个溶解氧浓度梯度变化的过程,观察到颗粒污泥由稳定存在到裂解再到再次快速形成稳定颗粒的全过程,并揭示了影响颗粒污泥稳定性的重要因素。

关键词： 雨生红球藻异养细胞   虾青素积累模型   光生物反应器   优化   放大  

摘要： 雨生红球藻是目前发现的最强抗氧化剂—左旋虾青素(最佳的天然虾青素)的唯一生物来源,因此雨生红球藻的大规模培养是目前生产天然虾青素的唯一方式。迄今,雨生红球藻的大规模培养技术主要是基于光自养的两阶段法,但雨生红球藻培养效率低且光生物反应器占地面积大,严重制约了天然虾青素产业的发展。为此,笔者所在团队在国内外首创“异养-稀释-光诱导串联”培养技术(SHDP),解决了户外光自养培养效率低及光生物反应器占地面积大的问题。SHDP技术中的异养细胞光诱导生产虾青素工艺已在户外光生物反应器进行了初步的中试研究,但为实现该技术的产业化,所用光生物反应器亟待放大与系统优化。剪应力是光生物反应器放大过程中的重要参数。但目前雨生红球藻的剪应力耐受性尚未阐明,缺少光生物反应器放大依据。此外,量化户外光强和温度对虾青素的影响是光生物反应器系统优化的重要基础。而目前缺少可用的模型,无法指导SHDP技术所用户外光生物反应器的系统优化。鉴于上述情况,本文首先确定了雨生红球藻异养细胞的临界剪应力,籍此对水平管光生物反应器放大过程所需要的泵进行优化,建立了单台体积达20 m3左右的水平管光生物反应器,并建成了光生物反应器总体积约420 m3的雨生红球藻光诱导基地;然后分别在鼓泡柱式光生物反应器及大型水平管光生物反应器中,建立了基于反应内部平均光强和藻液平均温度的雨生红球藻异养细胞虾青素积累模型(包括虾青素产率模型FFBC-ap和FFHT-ap,虾青素含量变化率模型FFBC-ac和FFHT-ac),并在户外对模型进行了验证;在此基础上,分别对水平管光生物反应器和列管光生物反应器的几何结构、摆放方向及操作条件进行优化,并筛选出最优的光生物反应器类型;最后,在全球范围内,利用所建立的FFHT-ap模型和FFHT-ac模型对适合雨生红球藻异养细胞光诱导的地点进行了筛选,为SHDP技术的全球推广奠定了重要的基础。本文主要结论如下:(1)雨生红球藻不动孢子(进入光诱导时的异养细胞基本为不动孢子)临界剪应力为19.18～27.32 Pa,且不同剪应力对不同虾青素含量的雨生红球藻不动孢子存活率没有显著影响。基于临界剪应力,成功将400 L水平管光生物反应器放大至20 m3,六叶半开式后弯叶轮离心泵是20 m3水平管光生物反应器中最佳的驱动泵。(2)在藻细胞密度0.218～2.5 g L-1及藻细胞虾青素含量0.47%～3.04%范围内,Cornet光衰减模型的预测性能优于Lambert-Beer光衰减模型;当藻细胞密度较低(0.4 g L-1)时,光衰减对细胞内虾青素含量的变化比较敏感;当藻细胞密度较高(2.0 g L-1)时,光衰减对细胞内虾青素含量不敏感。户外3 L鼓泡柱式光生物反应器中,所建立的FFBC-ap模型和FFBC-ac模型预测值与实测值相对偏差小于20%,模型预测性能较好。(3)在15.6 m3五排并联水平管光生物反应器中,所建立的FFHT-ap模型和FFHT-ac模型预测值与实测值的相对偏差不超过21.5%,模型预测性能较好;在此基础上,对五排并联水平管光生物反应器进行了正交优化,优化后全年虾青素面积产率为22.90 g m-2 year-1,优于文献报道的水平。(4)利用第三章建立的FFBC-ap模型和FFBC-ac模型,对100 L列管光生物反应器进行正交优化,优化后全年虾青素面积产率为204.39 gm-2 year-1,而利用第四章建立的FFHT-ap模型和FFHT-ac模型正交优化后的单排水平管光生物反应器,全年虾青素面积产率达297.15 g m-2 year-1,比列管光生物反应器高45.38%,同时比文献报道的水平高约12倍。(5)利用第四章建立的FFHT-ap模型和FFHT-ac模型,预测雨生红球藻规模化生产地点的全年虾青素面积产量,结果表明云南省保山市施甸县为22.90 gm-2,而美国夏威夷卡内奥湾为29.98 g m-2,最适合于雨生红球藻异养细胞光诱导,瑞典斯德哥尔摩市古斯塔夫斯堡全仅为4.50 gm-2,不适合雨生红球藻异养细胞光诱导。本文的上述研究不仅为雨生红球藻基于SHDP技术的高产虾青素这一新模式的产业化提供了高性能的光生物反应器,也为户外大规模光生物反应器的优化提供了依据,同时也为SHDP技术在全球推广奠定了重要基础。

摘要： Activated sludge process-based biological wastewater treatment is widely used for the treatment of wastewater. It cleans wastewater by transforming the suspended and dissolved solids to biomass and gases. While cleaning the wastewater, this process also produces a huge quantity of sludge that requires costly management. Sludge management cost represents around 60% of the collective operational cost of a wastewater treatment plant. With increasing number of wastewater treatment plants to serve the growing population, sludge production is rapidly increasing each year and its disposal has emerged as a serious challenge for the operators of wastewater treatment plants. Stringent regulations regarding pathogenic agents and other hazardous contaminants in sludge may restrict their disposal via conventional methods such as landfill, incineration, and agricultural reuse of biosolids. In the literature, various technologies have been considered to achieve sludge reduction while treating wastewater. One such option is the oxic-settling-anoxic (OSA) process where the main aerobic bioreactor is integrated with anoxic side-stream reactor and sludge is exchanged between these reactors maintaining different redox conditions. In this integrated process, sludge is retained for a temporary period in the side-stream reactors with low oxygen and substrate, and then it is recirculated to the main reactor for sludge reduction. Membrane Bioreactor (MBR) is an advancement over the conventional activated sludge (CAS) process for wastewater treatment. MBR combines biodegradation with membrane filtration to produce suspended solids free biologically treated effluent in a single step with a smaller footprint than the CAS process. Because of these inherent characteristics of MBR, it is interesting to assess the combination of the MBR-side-stream anoxic reactors for sludge yield reduction during wastewater treatment. However, there are gaps in understanding the mechanisms of sludge reduction in

关键词： 合成生物学   褪黑素   水稻   生物反应器   种质  

摘要： 合成生物学作为二十一世纪蓬勃发展的学科正显现出诱人的实力。目前植物合成生物学主要朝着两个方向展开探索,一是重建生理代谢通路以实现作物改良,二是利用植物作为底盘进行某些生物大分子或次生代谢物的生物合成。已有植物合成血清蛋白、疫苗抗原、花青素等物质的成功案例。作为高等自养生物,植物生物反应器对于成本、技术、储存条件的要求比微生物发酵更低,同时安全性更高。褪黑素具有生物代谢产物和保健品的双重身份,不仅能在动物体内起促进睡眠、抗氧化、提高免疫、保护肠道和神经等积极作用,也可以正向提升植物体抵抗各种生物和非生物胁迫的能力。经过多年的研究,褪黑素的生物合成通路已基本确定,同时食物中的褪黑素可被人体直接摄入。在此基础上,本研究以水稻为生物反应器,基于合成生物学的方法,尝试开展了在胚乳中合成褪黑素的相关工作,取得研究结果如下:1、设计并构建了4个重组元件,分别以PGluC启动Os T5H反义链、以PGlu B启动Cr SNAT、以PGlu A启动Os TDC3和以PSSA启动Os COMT。2、利用多基因堆叠系统TGSII将褪黑素生物合成通路中的3或4个关键酶基因T5H、SNAT、TDC、COMT构建成多基因载体。3、转基因植株MLT4G T0代含有1个、2个、3个、4个转入基因的株数分别为1株、7株、0株、11株;转基因植株MLT3G T0代含有1个、2个、3个转入基因的株数分别为1株、2株、16株。转基因植株生长状态无明显异常。4、MLT4G和MTL3G发育中种子的转入基因表达量较野生型显著升高。5、使用常规HPLC未检测到野生型、MLT4G和MLT3G糙米粉褪黑素的存在,说明其含量低于检测下限10 ng/g。本研究将褪黑素合成通路导入水稻胚乳,获得了以中花11背景的转基因材料,通过常规HPLC法初步判断野生型和转基因植株成熟种子褪黑素含量较低,暂无法判断转基因植株胚乳褪黑素含量是否升高。本研究为功能米的创制和稻米营养附加值的提高提供了新的生产思路并积累了经验。

关键词： 铜绿微囊藻   钾   镉   重金属生物去除   光生物反应器  

摘要： 镉(Cd2+)是最常见且毒性较强的重金属污染物之一,生物富集是去除Cd2+污染的常用方法。铜绿微囊藻是有害蓝藻水华中最为常见的优势藻种之一,因其特殊的细胞结构和生理特性而具有较好的重金属生物富集能力。另一方面,藻细胞的生长是实现重金属生物去除的基础。关于铜绿微囊藻生长的限制因素已有较为广泛的研究,而过去的研究主要关注氮和磷对其生长的影响,作为植物三大营养元素之一的钾（K+）的影响涉及尚少。随着工农业的发展,地表水中的K+已呈逐渐上升的趋势,这可能对水体中的初级生产者——浮游植物的生理生化过程产生影响,进而影响其他环境中污染物(例如Cd2+)的归趋。而目前,尚缺乏关于K+对浮游植物生理生化过程的调控、K+影响下浮游植物对去除其他污染物的效应和机制的研究。为了系统性地探究K+对铜绿微囊藻生理生化过程、对Cd2+的吸收能力是否具有调控作用及其内在机理,本论文首先研究了Cd2+对铜绿微囊藻的急性毒性;然后探究了不同K+浓度对铜绿微囊藻生长、光合、细胞结构、抗氧化系统、产毒性能的影响,并结合蛋白质组学中相对和绝对定量同位素标记（i TRAQ）技术揭示了其内在机理;在此基础之上,通过室内实验探究了不同K+浓度对铜绿微囊藻Cd2+去除能力的调控作用,并结合i TRAQ技术从细胞膜吸附、跨膜运输、胞内能量代谢过程响应三个角度进行了K+浓度调控铜绿微囊藻Cd2+去除能力的机理解析。最后,通过构建室内不产毒铜绿微囊藻光生物反应器（PBR）,进行含Cd2+矿山废水处理运行研究,通过分析运行过程中K+浓度的调控下PBR对矿山废水中Cd2+去除效率、铜绿微囊藻生物量、藻细胞官能团的响应,验证K+浓调控铜绿微囊藻Cd2+去除能力的潜在运用前景。主要研究结论如下:（1）在10-100μM的Cd2+暴露浓度下,铜绿微囊藻的生长受到了显著抑制,且Cd2+浓度越高,对铜绿微囊藻生长的抑制效应越强,其中100μM的Cd2+暴露下,藻细胞内叶绿素a的含量从初始的2.51×10-7μg?cell-1降低至1.7×10-7μg?cell-1;铜绿微囊藻细胞内的氧化损伤情况也表现出显著的Cd2+暴露时间-剂量正相关性,Cd2+对铜绿微囊藻的IC50为50μM。（2）K+浓度能够调控铜绿微囊藻的生长和微囊藻毒素（MCs）的合成。K+浓度的改变对铜绿微囊藻细胞生长速率、光合作用效率、细胞的完整性具有明显的影响。铜绿微囊藻生长的最佳K+浓度为0.46 m M,K+过低（K+=0 m M）或过高（K+=0.92m M）都不利于铜绿微囊藻生长、光合活性和细胞形态的完整性,最终使铜绿微囊藻的生物量分别降低了69%和19%;同时,K+缺失处理下铜绿微囊藻MCs释放量降低了75%。（3）K+浓度的变化可以显著调控铜绿微囊藻细胞内ABC转运体和光合作用通路关键蛋白质的表达量。在K+缺失处理中,铜绿微囊藻细胞膜上Fe3+转运系统底物结合蛋白（Afu A）的表达量被下调了51%,铁氧还蛋白（Fd）的表达量被下调了48%,整合所有数据分析得出,K+缺失处理所导致的Fe3+吸收量降低、ATP合成量不足、mcy基因相对转录丰度的下调,共同导致了铜绿微囊藻细胞内MCs的合成以及释放过程被显著抑制,其中胞内MCs的含量降低了45%,且藻细胞本身生物量的增长受限,共同导致了水相中MCs浓度的急剧降低,最终胞外MCs的含量仅为对照组（K+=0.46 m M）的25.89%。（4）K+的浓度能够显著调控铜绿微囊藻对Cd2+的吸收能力。在钾充足条件下（K+=0.46 m M）,镉主要通过重金属转运蛋白（如CAX1）进入铜绿微囊藻细胞并进行积累,显著抑制氨基酸生物合成（Biosynthesis of Amino Acid）通路,影响TCA循环、糖酵解等过程并造成细胞内的能量缺失,此外胞内积累的镉还会造成遗传物质的损伤,最终造成51%的细胞生长抑制率。相反,K+缺失引起铜绿微囊藻细胞膜上Cd2+转运蛋白（钙/质子反转运蛋白）的表达被显著下调31%,Cd2+外排蛋白（Na+/H+反向转运蛋白）的表达被显著上调39%,并由此显著削减了藻细胞内Cd2+的累积量,使细胞内Cd2+含量降低了71%。但是,K+缺失在降低铜绿微囊藻对Cd2+的去除能力的同时,也缓解了同等Cd2+暴露下铜绿微囊藻所受的胁迫。K+缺失环境中Cd2+暴露对铜绿微囊藻的毒性主要作用于光合作用系统,此时铜绿微囊藻细胞能够促进TCA循环、糖酵解等过程来增强抗逆性,最终使得细胞死亡率从K+充足条件下的51%降低至9%。（5）充足的K+供应能够提升不产毒铜绿微囊藻PBR的Cd2+去除效率。充足的K+供应下,模拟废水和稀释的含Cd2+矿山废水中铜绿微囊藻均能维持稳定生长,而在K+供应不足时,模拟废水和稀释废水中铜绿微囊藻生物量在第41 d比K+充足时分别下降了4

关键词： 造血干/祖细胞   细胞共培养   生物反应器   水凝胶微囊化   数值模拟  

摘要： 目前,造血干/祖细胞(Hematopoietic stem/progenitorcells,HS/PCs)的体外扩增是解决临床移植用HS/PCs数量短缺的有效途径之一,但离体培养通常伴随着其长期增殖活性的丧失。因此,体外培养如何能有效维持HS/PCs的干细胞活性且又能实现其大量扩增是当前亟待解决的关键问题。随着对造血系统的生理结构和功能调控的研究,仿生构建造血微环境来实现其有效扩增成为当前研究热点之一。而在基于生物材料构建HS/PCs微环境的不同方法中,关于固态介质、基质细胞和动态环境多参数综合作用的实验数据非常有限,本文系统构建了一种HS/PCs体外微囊化动态共培养模式,耦合基质细胞、水凝胶包埋HS/PCs和三维动态培养等多种实验参数,以期实现HS/PCs的有效扩增。以小鼠颅顶骨前成骨细胞(MC3T3-E1)作为HS/PCs动态共培养体系中的基质细胞,体外构建并评估适宜该基质细胞粘附培养的微球。以聚乳酸(Polylactic acid,PLLA)为基材,明胶溶液作为分散剂,通过乳化溶剂挥发法制备了三种聚乳酸基微球,并综合考察了这三种聚乳酸基微球的生物物理性能。实验结果表明聚乳酸/纳米羟基磷灰石(PLLA/nHA)微球在促细胞粘附、增殖和骨向分化方面均具有显著优势。因此,选择PLLA/nHA微球作为MC3T3-E1细胞在动态共培养环境中的粘附载体。构建并优化用于HS/PCs包埋培养的海藻酸钙/明胶胶珠。实验揭示了氯化钙、海藻酸钠和明胶对胶珠粒径、孔道分布、粘弹性、溶胀性、渗透性、收缩性和溶解时间等物理特性的影响。并且,实验发现由氯化钙、海藻酸钠和明胶浓度为2.5%、2.0%和0.5%(W/V%)制备的胶珠,其内包埋细胞的增殖活性最佳。因此,采用该组海藻酸钙/明胶胶珠包埋培养HS/PCs。利用FLUENT软件对两种动态共培养模型(旋转式生物反应器(The Rotary Cell Culture System,RCCS)和转瓶(Spinner Flask,SF))在不同转速时的流场环境,以及其内随机排布的PLLA/nHA微球和海藻酸钙/明胶胶珠的受力情况进行了数值模拟,以辅助筛选适宜的运行条件。RCCS可以维持相对稳定的环状层流的流场环境,40 rpm转速下两种小球表面所受流体剪切应力范围在0.001 Pa-1.108 Pa,满足两种细胞对流体剪切应力环境的要求,将其设定为RCCS运行条件。SF内桨叶上/下部区域产生了两个流体循环,底部存在一个相对静止的流体环流区,且这些区域中心的速度及压强较小,不利于物质交换,45 rpm转速下两种小球表面所受流体剪切应力范围在0.000 Pa-2.072 Pa,对比分析后将其设定为SF运行条件。完成脐带血单个核细胞(Mononuclear cells,MNCs)和CD34+细胞的分离与分选,考察了两种细胞在无血清单参数静态悬浮培养中的生长特性。两种细胞的生存状态随着培养时间的延长逐渐变差。短期培养下(<7天)MNCs中总有核细胞扩增倍数为1.00±0.1 1倍,CD45+CD34+和 CD34+CD38-细胞亚群的含量分别为 1.17%±0.15%和 0.96%±0.04%。而CD34+细胞中总有核细胞扩增了 5.63±0.54倍,对应两种亚群的含量分别为47.67%±9.29%和2.84%±0.23%。无血清单参数静态悬浮培养无法长时间(14天)促进HS/PCs的扩增并维持其原始干细胞活性。耦合基质细胞、水凝胶包埋和三维动态流场环境等实验参数,系统探讨了这一无血清多参数集成培养模式对HS/PCs扩增活性的影响。MNCs微囊化培养14天后,RCCS-Co组 CD45+CD34+和 CD34+CD38-细胞亚群的含量分别为 1.76%±0.16%和 2.61%±0.14%,总有核细胞扩增倍数为6.56±0.32倍,且高于其他培养组(P<0.001),对应两种亚群的平均扩增倍数分别为7.85倍和7.53倍。CD34+细胞微囊化培养14天后,RCCS-Co组总有核细胞扩增倍数为11.87±0.74倍,这两种细胞亚群的含量分别为67.57%±3.34%和12.57%±1.27%,也高于其他培养组(P<0.05),对应两种细胞亚群的平均扩增倍数分别为9.39倍和15.72倍,被包埋CD34+细胞的增殖分裂活性和集落形成能力较强。MC3T3-E1细胞和HS/PCs共培养在一定程度上刺激了 MC3T3-E1细胞加速分泌某些相关因子。本文构建的HS/PCs微囊化动态共培养模式,相比单参数静态悬浮培养,更有利于CD34+细胞的扩增和原始干细胞活性的维持。综上所述,本文系统构建了一种新型的HS/PCs微囊化动态共培养模式。这一无血清多参数集成培养模式,在满足两种细胞动态隔离共培养的同时,有效维持了 HS/PCs的

关键词： 动态膜生物反应器   生物膜   污水处理   无机颗粒   过滤性能  

摘要： 动态膜生物反应器(dynamic membrane bioreactor,DMBR)在处理污水时,依靠微网上原位形成的动态膜(dynamic membrane,DM),能够有效截留细小的颗粒物,可实现DMBR的低成本、低跨膜压差以及高通量运行。因此,近年来在污水处理和回用中受到越来越多的关注。当用DMBR处理市政污水时,无机颗粒是污水中常见成分,大量的无机颗粒不可避免的会进入DMBR中成为动态膜的一部分,不同粒径的无机颗粒物及其与微生物的相互作用是如何影响动态层的结构进而影响动态层的过滤行为尚不明确。在本研究中,建立了八个小试动态膜过滤装置和一个中试装置,考察了不同粒径的无机颗粒以及无机颗粒物与生物膜相互作用对动态膜结构、组分与长期过滤行为的影响。本研究主要结论如下:(1)当模拟进水中只含有大粒径的无机颗粒(比如沙粒,1.3-69.2μm)时,50天内出水浊度仍高于2.26 NTU,表明没有形成有效的动态层。但在此实验基础上向进水中加入小粒径的无机颗粒(比如黄泥,0.5-2.7μm),在第八天出水浊度小于0.60 NTU,表明形成了有效的动态层。当进水中只含有小粒径的黄泥或“沙粒+黄泥”的混合物时,出水浊度分别在第20天和第10天降低至1 NTU,表明粗颗粒和细颗粒能协同促进有效动态层的形成。(2)当进水中只含可降解有机物时,由此形成了以纯生物膜为主的DM,可以实现DMBR长期稳定的运行,出水浊度小于1 NTU和跨膜压差(Trans-membrane pressure,TMP)小于10 Pa,表明不含无机颗粒的纯生物膜是动态层的理想材料。(3)模拟废水中的无机颗粒会影响DM结构,进而影响DMBR的过滤行为,且影响与无机粒径大小有关。大粒径的无机颗粒(例如,沙粒1.3-69.2μm)会破坏DM结构并导致不稳定的出水浊度;而小粒径的无机颗粒(例如,黄泥0.5-2.7μm)容易沉积在支撑材料表面,形成厚而致密的DM。此外,无机颗粒物的加入会影响活性污泥系统以及动态层中的微生物群落结构,增加DM中生物量和EPS的含量,从而降低了DM的孔隙率并增加过滤阻力。(4)中试研究发现,实际污水中含有的小粒径无机颗粒会积聚在膜表面并成为DM的一部分,增加DM致密性并降低孔隙率,导致中试DMBR的过滤阻力迅速升高。因此,应用DMBR处理实际的城市废水时,应事先尽可能多的去除污水中的无机颗粒物。

关键词： rAAV2/HBoV1   家蚕杆状病毒表达系统   家蚕蚕蛹   BmNPV/AAV2Rep-HBoV1Cap   BmNPV/AAV2ITR-eGFP  

摘要： 腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)在基因治疗领域具有广阔的应用前景,它具有非致病性、低免疫原性、广泛的组织趋向性以及可以长期稳定地表达目的基因等优势。但是重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,r AAV)载体的产量和生产成本限制了其在基因治疗上的进一步发展。目前已开发出了多种r AAV生产方式,包括腺病毒生产系统、疱疹病毒生产系统、昆虫细胞杆状病毒生产系统等。利用重组杆状病毒表达系统在昆虫细胞中生产r AAV是一种高效灵活的生产方式,当前主要利用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,Ac MNPV)表达系统在Sf9细胞中生产r AAV载体。为了建立一个更高效、低成本的生产体系,以家蚕生物反应器为平台,利用家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)表达系统来生产一种重组嵌合型r AAV2/HBo V1载体。AAV2和HBo V1(Human Bocavirus type-I)都属于细小病毒科,以HBo V1的衣壳蛋白包装AAV2的基因组可以形成一种属间交叉的假包装嵌合型重组病毒r AAV2/HBo V1,它不仅具有HBo V1的组织趋向性,而且具备HBo V1衣壳的基因装载能力(～5.4kb),可以为肺部疾病的基因治疗提供一个针对性更强的独特嵌合型病毒载体。本实验中,首先鉴定了杆状病毒转移载体p Fast Bac-AAV2ITR-e GFP和p Fast Bac-AAV2Rep-HBo V1Cap,通过杆粒筛选和家蚕细胞系转染获得两个重组家蚕杆状病毒:r Bm NPV/AAV2ITR-e GFP和r Bm NPV/AAV2Rep-HBo V1Cap。细胞水平连续的共感染实验表明,e GFP、Rep及Cap蛋白均可以稳定表达至P4-P5代。直接注射两个P3 r Bm NPV共感染5龄起蚕的家蚕幼虫(菁松-镇江株),72h后观察到e GFP在幼虫体内高效表达。同时,解剖已感幼虫发现,脂肪体和血淋巴中蛋白表达量最高。另外,通过直接注射重组杆状病毒来共感染的家蚕蚕蛹,在感染48h后就已经出现蛋白表达,表明蚕蛹中蛋白的表达效率高于幼虫。rAAV的纯化方法对载体的产量和质量有很大的影响。密度梯度超速离心是实验室纯化r AAV的主要方法之一,适用于所有r AAV血清型,并且有利于去除空壳病毒。比较了氯化铯(Cs Cl)密度梯度超速离心与碘克沙醇(iodixanol)密度梯度超速离心纯化r AAV2/HBo V1的效果,发现碘克沙醇法的纯化质量要优于Cs Cl法,不仅用时更短,且分离纯度远高于Cs Cl法。针对纯化的r AAV2/HBo V1进行了定量和转导活性分析。根据q PCR定量得知,Bm N细胞样品中的r AAV2/HBo V1的平均产量约为2×10VG/cell,每只幼虫中的平均产量为2.5×10VG,每颗蚕蛹的平均产量可达到4.6×10VG。结果表明r AAV2/HBo V1在家蚕生物反应器中可实现高效生产,能够满足大规模低成本生产r AAV载体的要求。通过透射电子显微镜(TEM)观察到,纯化的r AAV2/HBo V1病毒空壳率仍然很高,表明这一生产系统仍需要进一步优化,如增加表达对HBo V1病毒衣壳包装很重要的NP1蛋白;或调整AAV2基因组与HBo V1衣壳基因的构成比例等。在人支气管上皮细胞(16HBE)中观察到纯化的r AAV2/HBo V1具备一定的转导活性,但荧光表达较低,推测由于r AAV2/HBo V1并不特异感染16HBE细胞造成的。气液界面上培养的极化的人呼吸道上皮细胞(HAE-ALI)是野生型HBo V1感染以及r AAV2/HBo V1载体体外转导的最佳细胞系,之后将尝试利用流式细胞荧光分选技术(FACS)更准确地在HAE-ALI细胞中检测r AAV2/HBo V1的转导活性。总之,我们建立了一个用于在家蚕杆状病毒表达系统中生产新型嵌合型r AAV2/HBo V1载体的BEV/昆虫生产系统,并总结出较高效的载体纯化方法。新系统可以成功地将r AAV2基因组假包装在HBo V1衣壳中形成一种具转导活性、可特异治疗人类肺部疾病的r AAV2/HBo V1载体。这项工作展示出了家蚕-昆虫生物反应器在r AAV载体的规模化生产上具有很大的应用潜力,为r AAV载体的生产提供了新的思路。