关键词:
腐尽生肌散
糖尿病溃疡
血管新生
均匀设计
摘要:
目的:通过均匀设计,确定腐尽生肌散中有效单体成分“槲皮素-山柰酚-松香酸-乳香酸”配伍促糖尿病溃疡(DU)创面愈合的最佳配伍组合,实现古方腐尽生肌散现代化应用。方法:遵循“均匀设计-药效试验-数学建模及模型验证”的思路,按照U14(14~5)均匀设计方案,以4味中药单体成分为考察因素,葡萄糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖率为药效学指标,使用DPS软件构建有效单体成分与药效学指标间的数学模型,最后通过细胞增殖与活性检测法(CCK-8)、细胞划痕愈合、小管形成、蛋白免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)对均匀设计结果进行验证。结果:在14组配伍中,与高糖模型组比较,配伍6组差异具有统计学意义且促增殖效应最强(P<0.05);经DPS建模后最终拟合出4个二次多项式回归方程Y_(1)~Y_(4),考虑到模型的拟合度、稳定性及实际应用的需要,方程Y_(1)~Y_(3)用于后续验证;同时为确保实验重复性,配伍6组也用于验证;并依次将配伍6组、方程Y_(1)~Y_(3)组重命名为新复方(1)~新复方(4),作为古方腐尽生肌散进行现代化应用的单体成分配伍形式。验证实验结果表明:CCK-8、划痕愈合和小管形成实验均表明,与空白组比较,50 mmol·L^(-1)葡萄糖刺激HUVEC后,其相应的细胞活力、创面愈合率和成管数量均明显下降;此外,还明显下调了血管生成相关细胞因子血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子2(FGF2)的表达水平及CD31的分泌。而给予复方(1)~(4)对其干预后,其中复方(1)和复方(3)则显著改善了50 mmol·L^(-1)葡萄糖诱导HUVEC损伤后的这些生物学功能。进一步从复方(1)和复方(3)的回归系数及各单体成分的相对剂量占比推断,松香酸、槲皮素、乳香酸均有促高糖环境下HUVEC血管新生的作用,且发挥主效应(偏相关系数为正,均>0.9);松香酸和乳香酸、山柰酚和乳香酸以交互作用形式促HUVEC血管新生(偏相关系数为正)。结论:复方(1)和复方(3)为最优配伍方案,可挽救高糖的抑制作用,刺激高糖环境下HUVEC增殖、迁移和成管能力,促进血管内皮生长因子A(VEGFA)、FGF2、CD31的表达,从而发挥促血管新生能力,以促DU创面愈合。该发现不仅证实了复方(1)和复方(3)具有良好的重现性和可行性,为合理构建数学模型以深入研究中药配伍理论提供了新思路和方法。