关键词:
白念珠菌
耐药性
探针熔解曲线分析
突变型
摘要:
随着免疫抑制剂与侵入性手术的应用,侵袭性真菌病的发病率逐渐上升,而由此出现的抗真菌药物大量使用也导致了真菌耐药性的增强.其中,白念珠菌(Candida albicans)对唑类药物耐药性日益明显,这对开发早期临床耐药性诊断方法提出了更大的需求.相关研究显示,白念珠菌的耐药性涉及到多种机制,其中erg11基因上的热点区突变是其产生唑类耐药性的主要机制之一.本研究旨在基于多色探针熔解曲线分析技术(MMCA)建立一种针对白念珠菌唑类耐药的分子检测方法,从而对3个热点突变区内的4种主要的突变类型进行基因分型.研究纳入了11株耐药和22株敏感的白念珠菌,通过对其进行药敏检测、耐药相关基因突变类型鉴定,建立真菌耐药表型与耐药基因型之间的联系.药敏结果显示,11株耐药株和22株敏感株的最低抑菌浓度(MIC)值分别为16~64μg/mL和0.5~1.0μg/mL.耐药基因型鉴定结果显示有erg11HS1热点区突变的菌株9株,erg11HS3热点区突变的菌株2株,未能鉴定到erg11HS2热点区突变的菌株,相关突变型与耐药性之间的联系符合预期结果.在此基础上,通过设计数对特异性引物和荧光探针,并筛选最佳反应程序,建立了一种鉴定有关突变型与野生型的MMCA检测体系.对该检测体系的效果进行了评估和验证:所有4种突变型和野生型均被准确分型,两者的溶解温度差异均大于3.5℃,检出限最低可达1.9×10^(2)拷贝数/mL,扩增效率均大于90%.在33例白念珠菌的样本中,以一代测序为标准,该体系检测的一致率为93.94%(31/33),不同物种间无特异性交叉.本研究为白念珠菌病的早期唑类药物耐药性诊断提供了新方法.