关键词:
心力衰竭
真武汤
细胞凋亡
线粒体自噬
H9C2
摘要:
目的:探讨真武汤含药血清对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌肥大细胞凋亡的影响,以及对细胞凋亡和线粒体自噬相关性的机制研究。方法:该实验首先采用不同浓度AngⅡ和真武汤含药血清对H9C2心肌细胞干预24 h,利用细胞增殖与活性检测(CCK-8)法检测H9C2心肌细胞存活率,筛选实验最适宜浓度;利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞培养上清液中B型钠尿肽(BNP)含量和免疫荧光检测细胞表面积验证心肌肥大细胞模型的构建。随后将实验分为空白组(20%空白血清)、模型组(20%空白血清+5×10^(-5)mol·L^(-1)AngⅡ)、真武汤含药血清低、中、高(5%、10%、20%含药血清)组及自噬抑制剂组(1×10^(-4)mol·L^(-1)3-MA)、自噬诱导剂组(1×10^(-7) mol·L^(-1)雷帕霉素)。利用流式细胞术检测H9C2细胞凋亡水平及线粒体膜电位变化情况;溶酶体探针(Lyso Tracker)和线粒体探针(Mito Tracker)共定位检测细胞自噬发生情况;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测细胞凋亡相关通路胱天蛋白酶-3(Caspase-3)、胱天蛋白酶-9(Caspase-9)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞色素C(Cyt C)及线粒体自噬相关通路中泛素蛋白连接酶(Parkin)、PTEN诱导的激酶1(PINK1)、螯合体1(p62)等mRNA相对表达情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞凋亡相关通路裂解的(cleaved)Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax、Bcl-2、Cyt C和线粒体自噬通路磷酸化泛素蛋白连接酶(p-Parkin)、磷酸化PTEN诱导的激酶1(p-PINK1)、p62、Bcl-2同源结构域蛋白(Beclin1)蛋白的相对表达情况,以及微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ/Ⅰ比值变化情况。结果:CCK-8显示,AngⅡ浓度在5×10^(-5)mol·L^(-1)时细胞活性较低;该浓度下心肌细胞表面积显著增大(P<0.01)、培养基上清液中BNP含量明显提高(P<0.05),故选用5×10^(-5)mol·L^(-1)的AngⅡ用于后续心肌肥大细胞的造模处理。与空白组比较,模型组与自噬抑制剂3-MA组细胞凋亡率显著升高(P<0.01)、线粒体膜电位显著下降(P<0.01);模型组细胞中红色和绿色荧光点数量明显减少;Bax、Caspase-3、Caspase-9、Cyt C、p62的mRNA相对表达趋势显著上调(P<0.01),Bcl-2、Parkin、PINK1基因的mRNA相对表达趋势显著下调(P<0.01);且Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Cyt C、p62蛋白相对表达趋势显著上调(P<0.01),LC3Ⅱ/Ⅰ显著降低,Bcl-2、p-Parkin、p-PINK1、Beclin1蛋白相对表达趋势显著下调(P<0.01);与模型组比较,真武汤含药血清各组及自噬诱导剂组细胞凋亡率显著下降(P<0.01)、线粒体膜电位下降比率显著减少(P<0.01),且呈现剂量依赖关系,且可见红色荧光和绿色荧光均增多,3-MA组红色和绿色荧光点数量显著减少;Bax、Caspase-3、Caspase-9、Cyt C、p62基因的mRNA相对表达趋势明显下调(P<0.05,P<0.01),Bcl-2、Parkin、PINK1的mRNA相对表达趋势显著上调(P<0.01);真武汤含药血清各组中Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Cyt C、p62蛋白相对表达趋势明显下调(P<0.05,P<0.01),LC3Ⅱ/Ⅰ显著上升,Bcl-2、p-Parkin、p-PINK1、Beclin1蛋白相对表达趋势显著上调(P<0.01)。结论:真武汤含药血清具有降低肥大细胞凋亡,提高细胞内线粒体自噬的作用,这与抑制细胞内Bax/Bcl-2/Caspase-3凋亡通路,调节线粒体自噬Parkin/PINK1通路有关。