关键词:
黄芪甲苷
心肌细胞
心肌酶
病毒性心肌炎
柯萨奇B组3型病毒
摘要:
目的探究黄芪甲苷(AS-Ⅳ)对柯萨奇B组3型病毒性心肌炎的保护作用及其机制,采用生物信息学分析方法进一步探索AS-Ⅳ发挥作用的潜在机制。方法60只8周龄雄性Balb/c小鼠,随机分为四组,即空白对照组(对照组)、病毒性心肌炎模型组(模型组)、AS-Ⅳ干预低剂量组(低剂量组)及AS-Ⅳ干预高剂量组(高剂量组),每组15只小鼠。低剂量组和高剂量组小鼠在病毒注射前使用AS-Ⅳ对小鼠进行预处理2周,根据实验设计,AS-Ⅳ的给药剂量分别为10、50 mg/kg,灌胃体积为3 ml/只。对照组和模型组小鼠灌胃相同体积的空白溶媒作为预处理。预处理结束后,模型组、低剂量组和高剂量组小鼠通过腹腔注射0.1 ml 103TCID50的柯萨奇B组3型病毒诱导病毒性心肌炎,而对照组小鼠腹腔注射相同体积的空白细胞悬液。病毒注射后,低剂量组和高剂量组小鼠继续进行AS-Ⅳ干预直到2周实验结束,在实验过程中每3天检测小鼠的体重和死亡情况。2周后处死小鼠,经过2周生存观察后收集外周血并分离血清,利用全自动生化分析仪检测心肌标志物水平;获得心脏组织进行分子生物学和病理学检测;使用苏木精-伊红染色法(HE)染色及Masson染色评估心肌损伤和纤维化水平;利用凋亡检测试剂盒检测心肌组织凋亡情况。然后利用生物数据库检索AS-Ⅳ干预与病毒性心肌炎相关靶点。使用string数据库及Cytoscape软件药物-靶点-疾病”网络分析,药物及疾病靶点基因取交集后使用metascape数据库进行Gene Ontology(GO)及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路富集分析,研究黄芪有效成分保护病毒性心肌炎的潜在分子机制。结果截至到干预后2周,对照组小鼠全部存活(15/15,100%),模型组存活6只(6/15,40%),低剂量组存活7只(7/15,47%),高剂量组存活12只(12/15,80%),四组存活率比较有统计学差异(P<0.05),其中对照组存活率高于模型组、低剂量组,有统计学差异(P<0.05);高剂量组存活率高于模型组,有统计学差异(P<0.05);而高剂量组和低剂量组存活率比较无统计学差异(P>0.05)。HE染色显示:对照组心肌细胞正常,肌纤维排列整齐,结构清晰,细胞连接紧密;模型组细胞水肿,排列紊乱,断裂,细胞间质水肿,可见炎性浸润;高剂量组和低剂量组比较模型组有不同程度的减轻,肌纤维排列较为规则,其中高剂量组改善更为明显。Masson染色显示:对照组中仅有少量胶原纤维分布于细胞间隙中,模型组中可见大量的胶原纤维分布,高剂量组和低剂量组较模型组明显减少。模型组小鼠的心肌凋亡率(72.56±6.25)%均显著高于对照组的(3.67±1.59)%、高剂量组的(22.48±4.69)%、低剂量组的(43.14±5.18)%,低剂量组高于对照组和高剂量组,高剂量组高于对照组,有统计学差异(P<0.05)。四组血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I、乳酸脱氢酶(LDH)、氨基末端脑利钠肽前体(NT-proBNP)比较均有统计学差异(P<0.05);模型组血清CK-MB、肌钙蛋白I、LDH、NT-proBNP高于对照组、低剂量组及高剂量组,低剂量组血清CK-MB、肌钙蛋白I、LDH、NT-proBNP高于对照组、高剂量组,高剂量组血清CK-MB、LDH、NT-proBNP高于对照组,有统计学差异(P<0.05);高剂量组和对照组血清肌钙蛋白I比较无统计学差异(P>0.05)。使用GeneCard数据库检索“AstragalosideⅣ”获得靶基因121个。同样的方法,在ETCM数据库检索获得272个靶基因。将所获得的靶基因去重后得到381个基因,其中lncRNA 3个,microRNA 10个。在ctdbase数据库验证及NCBI PubChem数据库查询,22个AS-Ⅳ化合物单体直接或间接与获得的368个mRNA有关。将这些靶基因纳入string数据库,选择种属为人类进行蛋白互作分析,设置相互作用的置信水平为0.4,最终获得有关联的节点数量337个,平均节点度为27.3,蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)富集P<1.0e-16,考虑相互作用显著。将1029个基因纳入string数据库,选择种属为人类进行蛋白互作分析,设置相互作用的置信水平为0.4,最终获得有关联的节点数量871个,平均节点度为70,PPI富集P<1.0e-16,考虑相互作用显著。将111个交集基因纳入string数据库,选择种属为人类进行蛋白互作分析,设置相互作用的置信水平为0.4,最终获得有关联的节点数量91个,平均节点度为33.1,PPI富集P<1.0e-16,考虑相互作用显著。通过Cytoscape软件将互作关系作图,构建病毒性心肌炎