关键词:
新型冠状病毒
亚基因组
实时荧光定量PCR
摘要:
目的基于SARS-CoV-2的N_sgRNA建立实时荧光定量PCR检测方并进行初步应用。方法基于Wuhan-Hu-1/2019_MN908947和亚基因组RNA(subgenomic RNA,sgRNA)形成机制设计合成N_sgRNA重组质粒及其特异性引物探针。将重组质粒做为模板,根据实验结果的Ct值、荧光强度、扩增曲线等筛选最佳反应条件和反应体系,并采用评价指标对优化后的SARS-CoV-2病毒N_sgRNA荧光定量PCR检测方法进行灵敏性、重复性和特异性评估。同时,将该方法初步应用于172份临床样本和256份城市生活污水的检测探索该方法实际应用的可能性。结果初步建立了检测新冠病毒N_sgRNA的qRT-PCR方法,该方法检测下限为20 copies/mL,批内重复(0.002%~0.767%)和批间重复(0.016%~0.752%)实验变异系数均小于1%,特异性实验仅有N_sgRNA重组质粒检出,建立的方法灵敏度较高,特异性较强,重复性好。临床样本HK.3、EG.5.1和JN.1及其亚分支与其流行时期对应的城市污水样本的Ratio_(sgRNA/gRNA)均具有统计学差异(P<0.05);同时期临床样本和污水城市样本中Ratio_(sgRNA/gRNA)中位数具有较强的相关性(相关系数r=1.000,P=0.010),提示污水样本与人群临床样本中Ratio_(sgRNA/gRNA)趋势一致。结论本研究建立了一种检测SARS-CoV-2的N_sgRNA实时荧光定量PCR方法,该方法具有灵敏度较高,特异性较强,重复性好的特点,可用于检测SARS-CoV-2感染性。