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关键词： 谷胱甘肽   镉   PK-15细胞   氧化损伤   细胞凋亡  

摘要： （目的）本研究探索了谷胱甘肽（Glutathione，GSH）对镉（Cadmium，Cd）所引起的PK-15细胞损伤的修复功能及其背后的作用机制。本研究主要针对猪肾PK-15细胞，利用MTT检测、光学显微镜观察、透射电镜观察、JC-1染色、彗星试验和流式细胞术等多种研究方法，检测GSH对Cd所造成的细胞氧化损伤及细胞凋亡的修复作用。研究结果显示，GSH显著缓解了Cd引起的PK-15细胞活性下降，维持ROS的稳态，从而缓解DNA和线粒体损伤及细胞凋亡等现象。Western blot结果表明，GSH可能通过上调抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达、下调促凋亡蛋白Bax的表达，进而对Cd诱导的PK-15细胞凋亡产生抑制作用。综上所述，GSH可以通过抑制氧化应激反应和减少细胞凋亡来缓解Cd诱导的PK-15细胞损伤。

关键词： 鲤疱疹病毒2型   鲤疱疹病毒3型   双重TaqMan qPCR  

摘要： 鲤疱疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus　2，CyHV-2）和3型（Cyprinid herpesvirus　3，CyHV-3）是鲤鲫鱼类及其杂交种的主要致病原，该病毒传染性强、致病率高，对水产养殖业危害严重。为快速、高效鉴别鲤疱疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）和3型（Cyprinid herpesvirus 3，CyHV-3），本研究针对鲤疱疹病毒基因组的保守序列，设计了2对特异性引物，通过优化反应条件，建立了检测CyHV-2和CyHV-3的双重TaqMan qPCR方法，，并对该方法特异性、灵敏性和重复性进行评价。同时利用该方法对实验室保存的金鱼（Carassius auratus var）和锦鲤（Cryprinus carpiod haematopterus）临床样品进行检测。结果显示，该方法能特异性检测CyHV-2和CyHV-3，而对水产其他常见DNA或RNA病毒均无交叉反应；敏感性试验表明，该方法的最低检测量均为1×101copies. μL-1，表明该方法具有较高的灵敏性；组内和组间重复变异系数均小于3%，重复性良好。使用该方法对实验室保存的37份金鱼和78份锦鲤临床样品进行检测，病毒检出结果与运用国家标准（GB/T 36194-2018）和行业标准（SC/T 7212.1-2011）方法检测的结果一致。对5份CyHV-2（金鱼样品）和5份CyHV-3（锦鲤样品）阳性的临床样品进行混合后检测，结果均为CyHV-2和CyHV-3双阳性。研究表明，本研究建立的双重Taqman qPCR检测方法具有特异性强、灵敏性高和重复性好的优点，可用于临床上CyHV-2和CyHV-3的快速定量检测和鉴别诊断。

关键词： 结核分枝杆菌   重组腺病毒   c-di-AMP   磷酸二酯酶   黏膜免疫  

摘要： 目的 构建表达结核分枝杆菌（Mtb）c-di-AMP磷酸二酯酶CnpB的重组腺病毒（rAd）并检测其诱导的体液免疫应答。方法经密码子优化的MtbCnpB编码基因克隆入质粒pcADV，获得的重组质粒pcADV-CnpB转染HEK293T细胞，并用Westernblot鉴定表达。重组pcADV-CnpB与骨架质粒共转染HEK293T细胞包装获得重组腺病毒rAd-CnpB，以HEK293T细胞扩增rAd-CnpB，Westernblot和免疫荧光检测rAd-CnpB表达目的蛋白。以rAd-CnpB滴鼻免疫小鼠，收集小鼠血清与肺泡灌洗液（BALF），ELISA检测抗原特异性抗体水平。结果酶切和测序鉴定表明重组质粒pcADV-CnpB构建成功，该质粒能够在真核细胞中表达。在HEK293T细胞内包装并获得rAd-CnpB，大量扩增并纯化获得滴度为5.53×1010PFU/mL的rAd-CnpB。rAd-CnpB可在HEK293T细胞中表达目的蛋白CnpB。rAd-CnpB滴鼻免疫小鼠，可诱导BALF中CnpB特异性IgG与分泌型IgA水平的增加，同时诱导血清中产生高水平的CnpB特异性IgG。结论成功构建表达Mtb c-di-AMP磷酸二酯酶CnpB的重组腺病毒rAd-CnpB，并且rAd-CnpB经黏膜免疫可诱导抗原特异性体液免疫与黏膜免疫应答，可用于结核病新疫苗策略的研究。

关键词： AM真菌   干旱胁迫   文冠果幼苗   光合作用   叶绿素荧光参数  

摘要： 【目的】探究丛枝菌根（arbuscularmycorrhizal,AM）真菌对干旱胁迫下文冠果生长和光合生理的影响,为干旱区文冠果的栽培提供技术支撑。【方法】以1年生文冠果幼苗为材料,采用盆栽控水试验,设置干旱和接菌2个因素,其中干旱处理设置正常供水（CK）、轻度干旱（T1）、中度干旱（T2）、重度干旱（T3）4个水平,接菌处理设置接种AM真菌（记作AMF）和不接种（记作NM）2个水平,进行完全组合设计,共计8个处理,测定不同处理文冠果幼苗的生物量以及叶片的色素(叶绿素a（Chla）、叶绿素b（Chlb）、类胡萝卜素（Car）)含量、光合参数(净光合速率（P_n）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）、胞间二氧化碳浓度（Ci）)和叶绿素荧光参数(最大光化学速率（Fv/Fm）、实际光化学效率（ΦPSⅡ）、表观电子传递速率（ETR）、光化学猝灭系数（q P）、非光化学猝灭系数（NPQ）),并分析了不同指标间的相关性,利用主成分分析对不同处理文冠果的表现进行了综合评价。【结果】无论接菌与否,与CK相比,干旱胁迫明显降低了文冠果幼苗的地上部和地下部分鲜质量、干质量。在同一干旱胁迫处理下,AMF处理地上部和地下部鲜、干质量均较NM处理明显增加。无论接菌与否,干旱胁迫对文冠果幼苗叶片的色素含量有明显影响,在相同干旱胁迫处理下,AMF处理的Chl b、Car含量均高于NM处理。无论接菌与否,与CK相比,干旱胁迫处理文冠果幼a、Chl苗叶片的P_n、Tr、Gs和Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR、q P均下降,而NPQ先上升后下降;接种AM真菌可稳定轻度干旱处理的Fv/Fm,以缓解干旱对光系统Ⅱ（PSⅡ）的伤害;干旱40d时,NM处理Ci的变化趋势与AMF处理Ci及P_n、Gs不一致,推测干旱胁迫40d是气孔限制转变为非气孔限制的关键节点。相关性分析结果表明,地上部和地下部的干鲜质量均与P_n呈极显著正相关,P_n与Fv/Fm呈极显著正相关。主成分分析结果显示,T1+AMF处理得分最高。【结论】干旱胁迫下,AMF处理通过激发文冠果幼苗叶片色素合成、提高净光合速率并减轻光抑制,进而降低干旱对植株的损伤,维持文冠果幼苗正常生长生理活动,其中轻度干旱胁迫下接种AM真菌的文冠果表现最佳。

关键词： 柴胡皂苷b1(Ssb1)   肝癌   凋亡   MCL1   STAT3   HSP90  

摘要： 目的该研究旨在探讨柴胡皂苷b1(Ssb1)对小鼠肝癌细胞Hepa1-6凋亡的影响及其作用机制。方法通过MTT法检测Ssb1对Hepa1-6小鼠肝癌细胞存活率的影响;蛋白免疫印迹法(WB)检测Ssb1对信号转导和转录激活因子(STAT3)、热休克蛋白90(HSP90)、髓样细胞白血病-1(MCL1)、剪切体半胱氨酸蛋白酶-9(C-Caspase9)和剪切体半胱氨酸蛋白酶-3(C-Caspase3)等蛋白表达水平的影响;采用钙黄绿素/碘化丙啶(Calcein-AM/PI)活/死细胞染色和细胞免疫荧光检测Ssb1诱导Hepa1-6细胞凋亡的情况。建立小鼠肝癌皮下移植瘤模型,观察Ssb1给药组小鼠体重和体积大小的变化情况;采用WB检测Ssb1对肿瘤组织中相关蛋白表达水平的影响情况;采用组织免疫荧光检测Ssb1对肿瘤组织中半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase3)表达的影响;采用苏木素-伊红(H&E)染色法观察Ssb1对肿瘤组织的影响。结果 与对照组相比,Ssb1组降低Hepa1-6细胞存活率,抑制Hepa1-6细胞中STAT3、HSP90和MCL1蛋白表达,上调C-Caspase9和C-Caspase3蛋白表达,死细胞数量增多,凋亡蛋白Caspase3荧光强度增加。与对照组相比,Ssb1组的小鼠体重变化不大,肿瘤体积变小,肿瘤组织中相关蛋白表达情况与细胞水平一致,肿瘤细胞核明显皱缩变小。结论 Ssb1通过抑制STAT3/HSP90下调抗凋亡蛋白MCL1表达,从而诱导肝癌细胞的凋亡。

关键词： 猪流行性腹泻病毒   传染性胃肠炎病毒   猪δ冠状病毒   RT-qPCR   检测方法  

摘要： 猪肠道冠状病毒（swine enteric coronaviruses， SeCoV），如猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）、传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus， TGEV）和猪德尔塔冠状病毒（porcine delta coronavirus， PDCoV），会引发仔猪严重腹泻，给养猪业造成了巨大的损失。本研究中，我们建立了一种三重实时荧光定量反转录PCR（reverse transcription-quantitative PCR， RT-qPCR）方法，用于同时检测PEDV、TGEV和PDCoV。首先根据PEDV M基因、TGEV ORF 1b基因和PDCoV ORF 1b基因的保守序列分别设计每种病毒的特异性检测引物和探针。优化反应条件后，成功建立了一种能同时检测PEDV、TGEV和PDCoV的三重RT-qPCR方法。该方法对这三种病毒具有良好的特异性，与猪场常见的CSFV、PCV2、PoRVA、PRV和PRRSV等均无交叉反应。对重组质粒pTOPO-PEDV 128、pTOPO-TGEV 116和pTOPO-PDCoV 125线性模板的检测极限分别为16.835、17.61和17.02拷贝/μL。组内、组间变异系数均小于5%，组间差异不显著（P>0.05）。此外，还比较了三重RT-qPCR与标准方法的符合性，结果显示符合率为100%，检测35份组织样本，17份呈PEDV阳性，阳性率为48.57%（17/35），TGEV和PDCoV检测结果均为阴性，未检测到混合感染。综上结果，建立的三重RT-qPCR方法特异、灵敏、稳定、快捷，可同时用于PEDV、TGEV和PDCoV的临床检测和鉴别诊断，为猪腹泻冠状病毒的检测和流行病学调查提供了一种检测方法。

关键词： 烟草轻型绿花叶病毒   地黄   RPA恒温扩增   快速检测  

摘要： 根据烟草轻型绿花叶病毒（tobacco mild green mosaic virus, TMGMV）的外壳蛋白（coat protein,CP）基因设计引物和探针，将重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification,RPA）和侧流层析试纸条（lateral flow dipstick,LFD）相结合，建立了一种TMGMV的快速检测方法，对该检测方法中的反应时间、反应温度进行了优化，并检测了该方法的特异性和灵敏度。试验结果表明，RTRPA-LFD检测体系的最佳反应条件是温度37℃、反应时间30 min。该方法能够特异性检测TMGMV，与其它病毒无交叉反应，对TMGMV CP的最低检测限度为1.65×10～0拷贝·μL-1，比普通PCR检测灵敏度高10倍。该方法灵敏度高、特异性强，能够用于田间地黄样品中TMGMV的检测，便于基层科研单位对该病毒的准确检测和诊断。

关键词： 土地利用变化   生态服务价值   CV-Markov模型   地理探测器   澜沧江-湄公河  

摘要： 科学评估流域生态系统服务价值（ESV），揭示其随土地利用变化的时空响应规律，识别影响ESV空间异质性的关键驱动因子，对于制定合理开发和保护策略，促进区域可持续发展具有重要意义。以澜沧江-湄公河流域为研究对象，采用CV-Markov模型模拟流域未来不同发展情景下土地利用变化，采用修正的当量因子法评估ESV，基于空间统计分析方法分析揭示土地利用变化影响下的ESV时空演变规律，并利用地理探测器模型识别ESV空间分异的关键驱动因子。结果表明：1)1995-2020年间，流域ESV总量、空间分布发生相应变化，总体呈先减小、后增大的趋势；2040年3种发展情景下流域ESV存在显著的差异性和空间异质性，其中农业发展情景ESV值最低、生态保护情境ESV最高；2）未来不同情景下流域ESV均存在显著空间正相关性和空间集聚效应，但不同情景下的ESV冷点/热点区域规模及其空间格局存在显著差异；3）流域ESV的空间异质性受到自然-人类活动的双重影响，其中人类足迹是ESV空间格局的主导驱动因子，年均气温、高程、坡度3个因子也是ESV空间异质性的关键驱动因子，且任意双因子组合对ESV空间异质性的解释力均强于单一因子，其中解释力最高的双因子为人类足迹与年均气温的组合。