关键词:
NS5A蛋白
牛
核糖体内部进入位点
牛病毒性腹泻病毒复制
摘要:
【目的】探究牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea viru,BVDV)NS5A的3个结构域与核糖体内部进入位点(internal ribosome entry site,IRES)的相互作用。【方法】采用PCR法扩增Ⅰ型BVDV病毒NS5A基因的3个结构域DomainⅠ、DoaminⅡ和DomainⅢ片段,分别连接到p ET-28a(+)载体上,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,对表达产物进行Western Blot鉴定,并用镍柱法进行纯化。PCR扩增IRES DNA,转录获得IRES RNA。使用生物层干涉法(BLI)生物传感器(Gator Bio.)分子互作分析仪器对NS5A 3个结构域与IRES RNA的相互作用进行分析。【结果】成功表达并纯化了DomainⅠ、DoaminⅡ和DomainⅢ结构域重组蛋白,其质量浓度依次为76.2,96.8和57.7μg/mL。体外转录获得了IRES RNA,其质量浓度为2 056.2μg/mL。互作分析结果表明,NS5A的3个功能结构域中,只有DomainⅡ与IRES具有明显的相互作用,且这种互作存在快结合快解离的现象,其与IRES的亲和力为7.93×10-6μmol/L。【结论】BVDV NS5A蛋白是调控IRES起始翻译的重要蛋白,其主要作用部位为DomainⅡ。