关键词:
重组慢病毒载体
淋巴细胞激活基因
免疫抑制性受体
慢性病毒感染
摘要:
目的 构建人淋巴细胞激活基因3(lymphocyte activation gene 3, LAG3)慢病毒重组表达载体,并转染小鼠成纤维细胞3T3以获得 LAG3优势表达的单克隆细胞株。方法 提取人外周血单核细胞总RNA并逆转录为cDNA,以高保真DNA聚合酶PCR扩增LAG3胞外区和跨膜区基因序列。PCR产物采用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切后,与慢病毒载体pTSB-copGFP连接构建重组表达载体pTSB-LAG3-copGFP,并转化大肠埃希菌DH5α。PCR法筛选出阳性克隆菌,提取质粒DNA测序验证。pTSB-LAG3-copGFP重组载体与包装质粒psPAX2、pMD.0G共同转染人胚肾293T 细胞以包装、分泌病毒,收集病毒感染3T3细胞,采用嘌呤霉素筛选的同时有限稀释法获取LAG3稳定表达的3T3单克隆细胞。实时荧光定量PCR、免疫荧光法和流式细胞术分别检测细胞中LAG3 mRNA的转录及LAG3蛋白的表达。结果 重组pTSB-LAG3-copGFP慢病毒载体测序结果显示,扩增LAG3基因序列与GenBank中LAG3标准序列(序列号NM_002286.6)比对仅在跨膜区1 697 bp碱基位存在一处His氨基酸密码子同义突变。pTSB-LAG3-copGFP包装病毒感染3T3细胞经嘌呤霉素筛选,共获得20株LAG3+copGFP+-3T3单克隆细胞,均可检测出LAG3 mRNA的转录,其中MC-6单克隆细胞株LAG3转录水平最高。免疫荧光法与流式细胞术检测结果提示LAG3蛋白在MC-6中有效表达并分布于细胞膜和胞质细胞器膜上。结论 成功构建pTSB-LAG3-copGFP慢病毒载体,筛选获得淋巴细胞激活因子3高效表达的LAG3+copGFP+-3T3单克隆细胞株。为后续开展LAG3与乙型肝炎等慢性病毒感染性疾病发展的关系以及LAG3干预治疗等实验研究打下基础。