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关键词： A型塞内卡病毒   遗传进化分析   3A蛋白   多克隆抗体  

摘要： A型塞内卡病毒(senecavirus A，SVA)作为一种可以引起猪水泡样症状的外来病原，与口蹄疫病毒引起的临床症状难以区分。本研究成功分离1株SVA，将其命名为HN2019。经全基因组测序和进化分析发现，该分离株与我国毒株CH-HN-2017亲缘性最高。该毒株可在猪肾传代细胞(PK-15)、乳仓鼠肾细胞(BHK-21)中有效复制增殖，感染后均能产生细胞病变。通过病毒一步生长曲线、间接免疫荧光、Western-blot等试验研究了该毒株的生物学特性。同时，利用pCold-TF质粒构建该毒株非结构蛋白3A的原核表达载体，转化大肠杆菌系统，发现该重组蛋白可在上清中可溶性表达。将纯化后的重组蛋白分4次免疫BALB/c小鼠，成功制备针对3A蛋白的多克隆抗体。该抗体效价为1∶128 000，可特异性识别病毒感染的细胞产生特异性荧光，证明该抗体具有良好的反应性和特异性，为进一步研究SVA 3A蛋白的生物学功能及病毒的致病机制提供有效工具。

关键词： 非洲猪瘟病毒   D250R蛋白   原核表达   多克隆抗体   间接ELISA  

摘要： D250R是非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染早期表达的具有脱帽酶活性的非结构蛋白。本研究构建了pET-32a-D250R重组原核表达质粒，经IPTG诱导和镍亲和纯化成功获得原核细胞表达的重组蛋白His-D250R，该蛋白和真核细胞表达的重组蛋白Flag-D250R均能被ASFV标准阳性血清识别，证明D250R蛋白是ELISA抗体检测方法的潜在靶标。在此基础上，以纯化的重组蛋白为免疫原制备鼠源多克隆抗体，该抗体ELISA效价大于1∶409 600。Western-blot试验表明该抗体与Flag-D250R和His-D250R均具有良好的反应性，证明His-D250R蛋白具有良好的抗原性。进一步以His-D250R蛋白为包被抗原，通过对抗原包被、封闭、抗体孵育、底物反应等条件的优化，建立间接ELISA抗体检测方法。其阴阳性临界值为0.359，检测PRV、PRRSV、PCV2、CSFV等阳性血清结果均呈阴性反应，灵敏度达1∶3 200，批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%，与商品化试剂盒符合率达98.8%。上述结果表明，基于His-D250R蛋白建立的间接ELISA抗体检测方法特异性、敏感性、重复性良好，具备一定临床应用价值，可以为非洲猪瘟诊断方法开发提供重要支持。

关键词： 微地膜   光照强度   群落结构   碳固定   碳降解  

摘要： 为揭示高温和不同光照条件下微小地膜碎片（微地膜）对土壤微生物群落结构和碳固定/碳降解功能的影响，本研究运用宏基因组测序技术，探究了强、弱光照下4种微地膜（传统黑地膜B、传统白地膜W、可降解黑地膜DB、可降解白地膜DW）对土壤微生物群落结构和碳固定/碳降解功能的影响。结果表明：可降解微地膜对细菌群落结构的影响程度比传统微地膜更强，如强光照下鞘氨醇单胞菌属在B、W、DB和DW组的相对丰度分别下降了30.4%、6.9%、40.8%和51.4%。微地膜对真菌群落结构的影响程度较细菌更显著，如篮状菌属在弱光照添加B微地膜条件下的丰度上升了47.8倍，强光照下B、DB和DW使其丰度增加了2.4、2.1和4.2倍。土壤pH、硝态氮和速效钾与微生物群落结构有显著相关性，光照和微地膜转变了土壤理化性质与微生物群落结构的正、负相关性。弱光照下B、W和DB显著提升了土壤碳固定功能丰度（5.1%～13.1%），强光照下B、DB和DW增加了土壤碳降解功能丰度（17.7%～20.6%）。研究表明，微地膜和光照共同影响土壤微生物群落结构，强光照下添加可降解微地膜的效应总体更显著，同时微地膜在特定光照下对碳固定/碳降解功能有一定促进作用，但可降解与传统微地膜的效应之间差异不大。

关键词： AM真菌   干旱胁迫   文冠果幼苗   光合作用   叶绿素荧光参数  

摘要： 【目的】探究丛枝菌根（arbuscularmycorrhizal,AM）真菌对干旱胁迫下文冠果生长和光合生理的影响,为干旱区文冠果的栽培提供技术支撑。【方法】以1年生文冠果幼苗为材料,采用盆栽控水试验,设置干旱和接菌2个因素,其中干旱处理设置正常供水（CK）、轻度干旱（T1）、中度干旱（T2）、重度干旱（T3）4个水平,接菌处理设置接种AM真菌（记作AMF）和不接种（记作NM）2个水平,进行完全组合设计,共计8个处理,测定不同处理文冠果幼苗的生物量以及叶片的色素(叶绿素a（Chla）、叶绿素b（Chlb）、类胡萝卜素（Car）)含量、光合参数(净光合速率（P_n）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）、胞间二氧化碳浓度（Ci）)和叶绿素荧光参数(最大光化学速率（Fv/Fm）、实际光化学效率（ΦPSⅡ）、表观电子传递速率（ETR）、光化学猝灭系数（q P）、非光化学猝灭系数（NPQ）),并分析了不同指标间的相关性,利用主成分分析对不同处理文冠果的表现进行了综合评价。【结果】无论接菌与否,与CK相比,干旱胁迫明显降低了文冠果幼苗的地上部和地下部分鲜质量、干质量。在同一干旱胁迫处理下,AMF处理地上部和地下部鲜、干质量均较NM处理明显增加。无论接菌与否,干旱胁迫对文冠果幼苗叶片的色素含量有明显影响,在相同干旱胁迫处理下,AMF处理的Chl b、Car含量均高于NM处理。无论接菌与否,与CK相比,干旱胁迫处理文冠果幼a、Chl苗叶片的P_n、Tr、Gs和Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR、q P均下降,而NPQ先上升后下降;接种AM真菌可稳定轻度干旱处理的Fv/Fm,以缓解干旱对光系统Ⅱ（PSⅡ）的伤害;干旱40d时,NM处理Ci的变化趋势与AMF处理Ci及P_n、Gs不一致,推测干旱胁迫40d是气孔限制转变为非气孔限制的关键节点。相关性分析结果表明,地上部和地下部的干鲜质量均与P_n呈极显著正相关,P_n与Fv/Fm呈极显著正相关。主成分分析结果显示,T1+AMF处理得分最高。【结论】干旱胁迫下,AMF处理通过激发文冠果幼苗叶片色素合成、提高净光合速率并减轻光抑制,进而降低干旱对植株的损伤,维持文冠果幼苗正常生长生理活动,其中轻度干旱胁迫下接种AM真菌的文冠果表现最佳。

关键词： 鲤疱疹病毒2型   鲤疱疹病毒3型   双重TaqMan qPCR  

摘要： 鲤疱疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus　2，CyHV-2）和3型（Cyprinid herpesvirus　3，CyHV-3）是鲤鲫鱼类及其杂交种的主要致病原，该病毒传染性强、致病率高，对水产养殖业危害严重。为快速、高效鉴别鲤疱疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）和3型（Cyprinid herpesvirus 3，CyHV-3），本研究针对鲤疱疹病毒基因组的保守序列，设计了2对特异性引物，通过优化反应条件，建立了检测CyHV-2和CyHV-3的双重TaqMan qPCR方法，，并对该方法特异性、灵敏性和重复性进行评价。同时利用该方法对实验室保存的金鱼（Carassius auratus var）和锦鲤（Cryprinus carpiod haematopterus）临床样品进行检测。结果显示，该方法能特异性检测CyHV-2和CyHV-3，而对水产其他常见DNA或RNA病毒均无交叉反应；敏感性试验表明，该方法的最低检测量均为1×101copies. μL-1，表明该方法具有较高的灵敏性；组内和组间重复变异系数均小于3%，重复性良好。使用该方法对实验室保存的37份金鱼和78份锦鲤临床样品进行检测，病毒检出结果与运用国家标准（GB/T 36194-2018）和行业标准（SC/T 7212.1-2011）方法检测的结果一致。对5份CyHV-2（金鱼样品）和5份CyHV-3（锦鲤样品）阳性的临床样品进行混合后检测，结果均为CyHV-2和CyHV-3双阳性。研究表明，本研究建立的双重Taqman qPCR检测方法具有特异性强、灵敏性高和重复性好的优点，可用于临床上CyHV-2和CyHV-3的快速定量检测和鉴别诊断。

关键词： 结核分枝杆菌   重组腺病毒   c-di-AMP   磷酸二酯酶   黏膜免疫  

摘要： 目的 构建表达结核分枝杆菌（Mtb）c-di-AMP磷酸二酯酶CnpB的重组腺病毒（rAd）并检测其诱导的体液免疫应答。方法经密码子优化的MtbCnpB编码基因克隆入质粒pcADV，获得的重组质粒pcADV-CnpB转染HEK293T细胞，并用Westernblot鉴定表达。重组pcADV-CnpB与骨架质粒共转染HEK293T细胞包装获得重组腺病毒rAd-CnpB，以HEK293T细胞扩增rAd-CnpB，Westernblot和免疫荧光检测rAd-CnpB表达目的蛋白。以rAd-CnpB滴鼻免疫小鼠，收集小鼠血清与肺泡灌洗液（BALF），ELISA检测抗原特异性抗体水平。结果酶切和测序鉴定表明重组质粒pcADV-CnpB构建成功，该质粒能够在真核细胞中表达。在HEK293T细胞内包装并获得rAd-CnpB，大量扩增并纯化获得滴度为5.53×1010PFU/mL的rAd-CnpB。rAd-CnpB可在HEK293T细胞中表达目的蛋白CnpB。rAd-CnpB滴鼻免疫小鼠，可诱导BALF中CnpB特异性IgG与分泌型IgA水平的增加，同时诱导血清中产生高水平的CnpB特异性IgG。结论成功构建表达Mtb c-di-AMP磷酸二酯酶CnpB的重组腺病毒rAd-CnpB，并且rAd-CnpB经黏膜免疫可诱导抗原特异性体液免疫与黏膜免疫应答，可用于结核病新疫苗策略的研究。

关键词： 马鞭草苷   HCoV-229E   蛋白质组学   A549   小鼠肺损伤   肺部炎症  

摘要： 目的：评价马鞭草苷对人冠状病毒229E（HCoV-229E）体内、外感染模型的药理作用，并通过蛋白质组学分析，初步探究马鞭草苷的抗病毒作用机制。方法：体外采用细胞活力检测试剂盒-8（CCK-8）建立HCoV-229E感染人肺腺癌细胞系（A549）细胞损伤的模型，将A549细胞作为5组，正常组、模型组和3个马鞭草苷处理浓度组(125 μmol·L-1、62.5 μmol·L-1、31.25 μmol·L-1)，通过细胞存活率检测、免疫荧光染色方法评价马鞭草苷的细胞保护活性；体内将30只Balb/c小鼠随机分为正常组、模型组、磷酸氯喹组、马鞭草苷高、低剂量组(40、20 mg·kg-1)，每组6只。建立HCoV-229E感染小鼠肺损伤模型评价马鞭草苷的治疗作用。分别通过检测肺指数、肺抑制率评价肺部损伤情况，酶联免疫吸附测定法（ELISA）评价肺部炎症因子的严重程度、微型计算机断层扫描（micro-CT）检测肺部的形态和结构、苏木素-伊红（HE）染色评价肺组织病理学改变；进一步采用四维数据独立组识别（4D-DIA）蛋白质组学方法，通过差异表达蛋白筛选、功能注释、富集分析及蛋白互作网络分析方法，初步分析马鞭草苷治疗HCoV-229E感染小鼠肺损伤模型的可能机制。结果：A549细胞选用HCoV-229E原倍浓度感染36 h建立体外感染模型，马鞭草苷的最大无毒浓度为125 μmol·L-1，半数细胞毒性浓度(CC50)值为288.8 μmol·L-1。与正常组比较，模型组细胞存活率显著下降（P<0.01），死亡细胞比例明显增加（P<0.01），线粒体损伤，膜电位明显降低（P<0.01）；而不同浓度马鞭草苷(125、62.5、31.25 μmol·L-1)处理后，均能显著提高细胞存活率（P<0.01），降低细胞死亡比例（P<0.01），并调节线粒体膜电位（P<0.01）。体内实验进一步验证了马鞭草苷对HCoV-229E感染小鼠的治疗作用。与正常组相比，模型组小鼠肺指数显著升高（P<0.01），肺组织损伤明显加重，肺部体积肿大，炎症因子白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达显著升高（P<0.01）。而在马鞭草苷处理组中，这些病理改变显著改善，肺指数降低（P<0.01），肺组织损伤减轻，肺部体积肿大缓解，炎症因子表达也显著降低（P<0.01）。蛋白质组学分析结果显示，与正常组相比，模型组富集到多种与抗病毒免疫反应相关信号通路，包括核因子-κB（NF-κB）信号通路（P<0.05）。而与模型组相比，马鞭草苷组富集到多种与炎症反应和自噬相关的信号通路（P<0.05），提示马鞭草苷可能通过调节这些信号通路发挥其抗病毒和抗炎作用。结论：马鞭草苷在HCoV-229E感染体内、外模型中均表现出较好的治疗作用，其机制可能与NLRP3炎症小体通路和线粒体自噬有关。

关键词： 痰热清胶囊   流行性感冒   肺-肠轴   肠道菌群  

摘要： 基于“肺-肠轴”探讨痰热清胶囊对流感病毒感染小鼠的肺肠保护作用。110只C57BL/6J小鼠随机分为对照组，模型组，奥司他韦组，痰热清胶囊低、高剂量组，每组22只，取每组10只小鼠开展体质量保护实验，12只小鼠进行机制探索实验。使用流感病毒A/Puerto Rico/08/1934（PR8）对小鼠进行滴鼻感染造模。第3天灌胃后采集小鼠肺组织，第7天灌胃后采集肺与结肠组织、粪便。结果显示，痰热清胶囊可缓解PR8感染所致的体质量降低，同时提高小鼠生存率。与模型组相比，痰热清胶囊可通过降低肺指数，减轻肺组织炎症水肿，在感染后期降低病毒基因表达，降低中性粒细胞百分比和升高T细胞百分比来缓解肺损伤；其还可通过恢复结肠长度，增加肠腔黏液蛋白分泌，减轻肠道炎症和减少杯状细胞破坏来缓解肠损伤。肠道菌群分析显示，与模型组相比，痰热清胶囊可升高物种多样性，在门水平可显著增加厚壁菌门Firmicutes和放线菌门Actinobacteria的丰度，显著降低拟杆菌门Bacteroidota和变形菌门Proteobacteria的丰度，以维持菌群稳态；在属水平可显著增加unclassified-f-Lachnospiraceae菌属的丰度，显著降低Bacteroides、Eubacterium和Phocaeicola菌属的丰度，以维持菌群稳态。综上所述，痰热清胶囊可缓解流感病毒感染小鼠的肺和肠损伤，恢复肠道菌群稳态失衡。从肺肠同治角度治疗流感，为临床提供新思路。