关键词:
骨关节炎
淫羊藿苷
微小RNA-29c
II型胶原α1链
细胞凋亡
摘要:
目的:探讨淫羊藿苷(icariin,ICA)对骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨细胞功能的影响及其机制。方法:用不同浓度(0.1、0.5、1.0、5.0或10.0μmol/L)ICA处理软骨细胞后,采用噻唑蓝(methylthiazolydiphenyl-tetrazolium,MTT)法检测软骨细胞活力,选择最适浓度的ICA进行后续实验。利用白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β;10 ng/mL)刺激软骨细胞24 h构建OA细胞模型,用最适浓度1μmol/L ICA处理细胞。采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RTqPCR)检测微小RNA-29c(microRNA-29c,miR-29c)的表达水平,蛋白免疫印迹(Western blot)检测Ⅱ型胶原α1链(collagen type II alpha 1 chain,COL2A1)蛋白的表达水平,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞培养上清液中基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3,MMP-3)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)水平,流式细胞术检测细胞凋亡水平。生物信息学网站预测miR-29c的靶基因,采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-29c与COL2A1之间的靶向结合作用。通过挽救实验阐明ICA对OA炎症反应及细胞凋亡的影响及作用机制。结果:与Control组相比,IL-1β组软骨细胞上清液中MMP-3(P=0.006)和TNF-α(P=0.002)含量明显增加,COL2A1的表达水平显著降低(P=0.001),细胞凋亡率显著增加(P=0.01);与IL-1β组相比,ICA处理组中软骨细胞上清液中MMP-3(P=0.019、P=0.005)和TNF-α(P=0.013、P=0.005)含量明显减少,COL2A1的表达水平显著升高(P=0.030、P=0.028 3),细胞凋亡率显著降低(P=0.038 9、P=0.016 9)。与Control组相比,IL-1β组软骨细胞中miR-29c表达水平显著上调(P=0.001 5),而ICA处理则明显降低miR-29c表达水平(P=0.025 6)。与miR-NC组相比,miR-29c mimic组中软骨细胞上清液中MMP-3(P=0.004 9)和TNF-α(P=0.031 9)含量明显增加,COL2A1的表达水平显著降低(P=0.017 1),细胞凋亡率显著增加(P=0.0136),而miR-29c inhibitor组则得到相反的结果。TargetScan7.1数据库显示miR-29c与COL2A1存在结合位点。双荧光素酶报告基因实验表明,miR-29c mimic明显抑制了野生型COL2A1载体的荧光素酶活性(P<0.000 1),而突变型的荧光素酶活性不受影响(P=0.1518)。敲低COL2A1可部分逆转下调miR-29c对软骨细胞中MMP-3(P=0.005 9)和TNF-α(P=0.003 3)分泌量,COL2A1蛋白表达水平(P=0.013 6)以及细胞凋亡率(P=0.002 5)的影响。ICA处理可减轻过表达miR-29c对软骨细胞中MMP-3(P=0.009 6)和TNF-α(P=0.005 2)分泌量、COL2A1蛋白表达水平(P=0.008 8)以及细胞凋亡率(P=0.011 6)的影响。结论:ICA能减轻IL-1β诱导的软骨细胞炎症因子的分泌和细胞凋亡的发生,其作用机制可能与miR-29c/COL2A1轴有关。