关键词:
锌指抗病毒蛋白
肠道病毒A组71型
细胞焦亡
自噬
摘要:
目的探讨锌指抗病毒蛋白对肠道病毒A组71型(EV-A71)感染引起的细胞焦亡和自噬的影响。方法将人正常胃上皮细胞(GES-1)细胞随机分为对照组(不感染EV-A71病毒)和感染组(感染EV-A71病毒),采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞活力,RT-PCR检测细胞中VP1 mRNA表达,采用二噁英染色(Dil染色)和4',6-二氨基-2-苯基吡啶核染色(DAPI核染色)检测细胞数量和形态。将GES-1细胞随机分为对照组(不感染EV-A71病毒)、EV-A71组(用MOI=5感染的EV-A71感染GES-1细胞)和pc DNA3.1-ZAP组(在EV-A71组的基础上转染pc DNA3.1-ZAP质粒)。测定细胞培养半数感染量(CCID50),ELISA检测细胞培养液中IL-18和IL-1β水平,CCK-8检测细胞活力,蛋白质印迹法检测细胞中自噬相关蛋白LC3、p62及焦亡相关蛋白NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白表达。结果CCK-8检测结果显示,随着MOI和感染时间的增加,EV-A71对GES-1细胞增殖活力的抑制作用越显著。和对照组比较,EV-A71感染GES-1细胞后细胞中VP1 mRNA表达[(2.14±0.21)比(1.00±0.10),t=12.01,P<0.01]明显增加,细胞数量明显减少,细胞核固缩且大小不均。和EV-A71组相比,pc DNA3.1-ZAP组上清液中EV-A71病毒滴度明显降低[(5.21±0.25)比(7.32±0.41),t=10.76,P<0.01]。和对照组比较,EV-A71组细胞培养上清液中IL-18[(64.32±7.18)pg/ml比(20.16±2.32)pg/ml,t=14.34,P<0.01]、IL-1β[(79.38±8.05)pg/ml比(24.11±3.16)pg/ml,t=15.65,P<0.01]水平、细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值[(1.42±0.14)比(1.00±0.10),t=5.980,P=0.01]、NLRP3[(1.12±0.15)比(0.25±0.03),t=13.93,P<0.01]、caspase-1[(0.74±0.08)比(0.32±0.04),t=11.50,P<0.01]、GSDMD[(0.49±0.06)比(0.26±0.04),t=7.813,P<0.01]蛋白表达均明显升高,细胞活力[(62.31±3.86)%比(100.00±10.00)%,t=8.613,P<0.01]、p62蛋白表达[(0.21±0.04)比(0.98±0.10),t=17.51,P<0.01]明显降低;和EV-A71组相比,pc DNA3.1-ZAP组细胞培养上清液中IL-18[(32.09±4.05)pg/ml比(64.32±7.18)pg/ml,t=9.577,P<0.01]、IL-1β[(39.26±4.12)pg/ml比(79.38±8.05)pg/ml,t=10.60,P<0.01]水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值[(1.15±0.12)比(1.42±0.14),t=3.587,P=0.0050]、NLRP3[(0.41±0.05)比(1.12±0.15),t=11.00,P<0.01]、caspase-1[(0.57±0.06)比(0.74±0.08),t=4.164,P=0.0019]、GSDMD[(0.34±0.05)比(0.49±0.06),t=4.704,P=0.0008]蛋白表达明显降低,细胞活力[(89.71±5.12)%比(62.31±3.86)%,t=10.47,P<0.01]、p62蛋白表达[(0.56±0.07)比(0.21±0.04),t=10.63,P<0.01]明显升高。结论过表达ZAP对EV-A71感染所致的细胞自噬和焦亡发挥抑制作用,从而对细胞EV-A71感染达到治疗目的。