关键词:
水稻草状矮化病毒
外壳蛋白
载体构建
酵母双杂交
亚细胞定位
双分子荧光互补
蛋白互作
摘要:
【目的】明确水稻草状矮化病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV)外壳蛋白CP的自身互作,为揭示CP蛋白在RGSV侵染中的功能提供理论依据。【方法】利用酵母双杂交(Y2H)技术鉴定RGSV CP与CP蛋白之间的互作。提取感染RGSV水稻叶片的总RNA,通过RT-PCR扩增得到CP基因。将CP基因分别构建到酵母表达载体pGBKT7和pGADT7上,利用菌液PCR鉴定阳性克隆。将酵母质粒组合pGBKT7-CP/pGADT7、pGBKT7-CP/pGADT7-CP、阳性对照pGADT7-T/pGBKT7-53、阴性对照pGADT7-T/pGBKT7-Lam分别转化到酵母感受态细胞Y2HGold中,先后涂布于缺陷型培养基SD/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal上。通过观察酵母细胞在缺陷培养基上的生长和显色情况鉴定CP蛋白的毒性、自激活活性和自身互作关系。利用亚细胞定位和双分子荧光互补(BiFC)鉴定CP在本氏烟中的定位及互作。将CP构建到植物瞬时表达载体pEarleyGate101(101)、pEarleyGate202-YN(YN)、pEarleyGate202-YC(YC)上,并利用菌液PCR鉴定阳性克隆。将阳性克隆101-CP、YN-CP、YC-CP、空载体YN、YC分别转化到农杆菌GV3101中。将含阳性质粒101-CP的农杆菌单独注射本氏烟叶片;将含阳性质粒YN-CP/YC-CP、阴性对照YN-CP/YC、YN/YC-CP的农杆菌共注射本氏烟叶片;利用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的发光和定位。【结果】RT-PCR扩增得到CP基因,其大小为978bp。成功构建酵母表达载体pGBKT7-CP和pGADT7-CP。含质粒pGBKT7-CP/pGADT7、pGBKT7-CP/pGADT7-CP、阳性对照和阴性对照的酵母菌均能在缺陷培养基SD/-Leu/-Trp平板上生长,且含质粒pGBKT7-CP/pGADT7的酵母菌的生长情况与对照一致,说明CP蛋白对酵母菌无毒性。但仅含质粒pGBKT7-CP/pGADT7-CP的酵母菌和阳性对照可在缺陷培养基SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal平板上生长并显色,表明CP蛋白无自激活活性,且CP蛋白在酵母细胞中能够自身互作。成功构建CP基因的植物表达载体;亚细胞定位结果显示,CP蛋白主要定位于本氏烟细胞的细胞核和细胞膜上。BiFC结果显示CP存在自身互作,且互作也定位于本氏烟细胞的细胞核和细胞膜。【结论】水稻草状矮化病是由水稻草状矮化病毒引起的,给粮食产量造成了严重威胁。RGSVCP是该病毒的外壳蛋白,可能在病毒复制、装配、侵染等过程中发挥着重要的作用。通过亚细胞定位、Y2H和BiFC鉴定了RGSVCP的定位和自身互作,为CP蛋白的功能研究提供参考,为解析RGSV的致病机制提供依据。