关键词:
肝微核实验
甲醛固定
胶原酶消化
摘要:
目的建立并验证基于4%中性甲醛固定肝组织制备肝细胞的大鼠肝微核实验(LMNT)方法(甲醛固定-LMNT法)。方法(1)SD大鼠分为雌性和雄性组,然后分别随机分为溶剂对照组和肝微核阳性化合物N-亚硝基二乙胺(DEN)12.5 mg·kg^(-1)组,每组5只,分别ig给予生理盐水和DEN,每天1次,连续14 d后取肝组织,同时用胶原酶消化-LMNT法和甲醛固定-LMNT法检测微核化肝细胞数量和处于有丝分裂期肝细胞数,分别计算肝细胞微核率和有丝分裂指数,肝细胞微核率>0.07%判定为阳性结果。(2)雄性SD大鼠分为喹啉(30,60和120 mg·kg^(-1))组、N-亚硝基吡咯烷(NPYR,25,50和100 mg·kg^(-1))组、各自溶剂对照组(NPYR,去离子水;喹啉,玉米油)及阳性对照DEN(12.5 mg·kg^(-1))组,每组5~6只,连续ig 15 d。每日记录体重,实验结束取肝记录肝总重,计算肝系数。自动生化分析仪检测肝功能相关血清生化指标谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)活性和血清总胆红素(T-BIL)、直接胆红素(D-BIL)的水平。采用胶原酶消化-LMNT法和甲醛固定-LMNT法测定肝细胞微核率,用外周血微核实验和肝彗星实验评价喹啉和NPYR遗传毒性。结果(1)与各自溶剂对照组的肝细胞微核率(0.069%和0.030%)相比,甲醛固定-LMNT法测得的DEN组雄性大鼠肝细胞微核率为1.10%,雌性大鼠为0.82%,均显著升高(P<0.05);与各自溶剂对照组(0.060%和0.030%)相比,胶原酶消化法-LMNT法测得的DEN组雄性大鼠肝细胞微核率为1.45%,雌性大鼠为0.46%,均显著升高(P<0.05),判定为阳性。2种方法中雄性大鼠的肝细胞微核率均显著高于雌性(P<0.05)。与各自溶剂对照组相比,2种方法测得的DEN组雄性和雌性大鼠肝细胞有丝分裂指数均无明显差异。(2)与溶剂对照组相比,NPYR 50和100 mg·kg^(-1)组大鼠体重在ig第7~14天显著降低(P<0.01),DEN组在ig第8~14天显著降低(P<0.01);喹啉120 mg·kg^(-1)组大鼠在ig第4~14天显著降低(P<0.01),DEN组在ig第10~14天显著降低(P<0.05)。与溶剂对照组相比,NPYR 100 mg·kg^(-1)组(P<0.01)和DEN组(P<0.05)的肝重和肝系数均显著降低;喹啉60和120 mg·kg^(-1)组肝重(P<0.01)和肝系数(P<0.05)均显著增加。与溶剂对照组相比,DEN组大鼠血清T-BIL水平显著升高(P<0.01),NPYR 100 mg·kg^(-1)组GPT、GOT活性和D-BIL、T-BIL水平均显著升高(P<0.01),NPYR 25,50 mg·kg^(-1)和喹啉各剂量组则均无显著差异。甲醛固定-LMNT法测得的NPYR组肝细胞微核率较胶原酶消化-LMNT法略高,均判定为阳性;与溶剂对照组相比,2种方法测得的NPYR组肝细胞微核率均显著增加(P<0.05),喹啉组结果相当,均判定为阳性;2种方法测得的喹啉组肝细胞微核率均显著增加(P<0.05)。2种方法测得的NPYR和喹啉组肝细胞微核率相关性较好(R2分别为0.8614和0.9279)。NPYR组外周血微核实验为阴性,彗星实验结果为阳性;喹啉组外周血微核实验和彗星实验结果均为阴性。结论初步建立并验证了甲醛固定-LMNT法,且该方法检测肝致癌物的灵敏度与胶原酶-LMNT法相近。