关键词:
神经肽
呼吸道合胞病毒
感染
固有免疫
干扰素
神经肽
半衰期
呼吸道合胞病毒
干扰素
摘要:
第一部分VIP增强RSV感染后Ⅰ型干扰素产生的机制研究
目的:呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是全球范围内引起5岁以下婴幼儿急性下呼吸道感染的最常见病原体。Ⅰ型干扰素是宿主最重要的抗病毒因子,而RSV感染后通过多种途径抑制Ⅰ型干扰素产生,从而实现免疫逃逸,影响宿主对病毒的防御和清除。诱导Ⅰ型干扰素产生对抗RSV感染极为重要。本研究拟通过体内外实验证明血管活性肠肽(Vasoactive intestinal peptide,VIP)是RSV感染后Ⅰ型干扰素产生的调控因子。
方法:本研究构建了 VIP全基因敲除小鼠,在RSV感染12h、24h运用qPCR检测肺组织Ⅰ型干扰素表达水平;感染后24h运用流式细胞术检测肺组织单细胞悬液肺泡巨噬细胞(AMs)的比例;感染后第3天和第5天运用qPCR检测肺组织病毒载量,并进行肺组织病理切片和苏木精-伊红,以评估肺组织炎症浸润情况。在体外培养肺泡巨噬细胞系MH-S和肺泡上皮细胞系HPAEpic、A549,分别检测VIP处理后病毒载量和Ⅰ型干扰素产生情况;CCK-8法检测RSV感染前后VIP对MH-S细胞活性的影响;将小鼠肺泡巨噬细胞系MH-S与小鼠肺泡上皮细胞系MLE12共培养,检测VIP干预的肺泡巨噬细胞培养上清是否能对肺泡上皮细胞内的病毒复制产生影响;运用转录组测序数据分析RSV感染BALB/C小鼠的肺组织VIP受体表达情况;运用qPCR检测MH-S细胞系VIP受体表达情况。
结果:与WT小鼠相比,VIP-/-小鼠感染12h后IFN-α、β表达显著减低;感染后第5天,VIP-/-小鼠肺部病毒载量显著高于WT小鼠;感染后第3天和第5天,VIP-/-小鼠肺组织炎症细胞浸润比WT小鼠更重;感染后24h,与WT小鼠相比,VIP-/-小鼠肺组织中肺泡巨噬细胞的比例下降更多。RSV感染HPAEpic、A549细胞后,VIP对Ⅰ型干扰素分泌和病毒载量无显著影响;给予MH-S不同浓度VIP干预,CCK-8法检测发现细胞活性没有显著改变;在RSV感染后,给予MH-S不同浓度VIP干预,与非干预组相比,细胞活性出现不同程度的恢复,其中给予MH-S 500nM VIP干预时,细胞活性恢复程度达到高峰;在RSV感染的MH-S中,VIP干预组IFN-α、IFN-β的mRNA表达升高,病毒载量无显著变化,VIP干预组Ⅰ型干扰素受体IFNAR1、干扰素刺激基因 15(Interferon stimulated gene 15,ISG15)同样表达升高;用不同组别的MH-S培养上清去刺激RSV感染后的MLE-12,结果显示VIP处理组的MH-S培养上清使MLE-12胞内病毒载量有下降趋势;RSV滴鼻感染BALB/C小鼠,感染后24H取肺组织进行转录组测序分析,结果显示肺组织VIP受体VPAC1、VPAC2表达水平降低;RSV体外感染肺泡巨噬细胞系MH-S,感染后24H VIP受体VPAC1、VPAC2表达水平无显著变化。
结论:VIP-/-小鼠在RSV感染后Ⅰ型干扰素表达较低,病毒载量较高,炎症浸润更重,肺泡巨噬细胞比例下降更多;VIP能促进肺泡巨噬细胞系分泌Ⅰ型干扰素,而对上皮细胞系无此作用,进一步证实RSV感染后VIP作用的靶细胞是肺泡巨噬细胞;VIP受体的表达情况不能解释VIP在感染后发挥作用的原因。
第二部分 Heps in介导VIP增强RSV感染后Ⅰ型干扰素产生的作用研究
目的:VIP属于低分子量多肽,半衰期短,延长其半衰期对于机制研究和成药均具有重要意义。第一部分结果表明VIP调控RSV诱导的Ⅰ型干扰素反应,本研究将构建VIP-Fc分子深入研究VIP增强RSV感染后Ⅰ型干扰素产生的作用机制,有望为寻找RSV防治新策略提供重要的思路。
方法:本研究将VIP与Fc偶联,通过真核表达和亲和层析的方式纯化得到VIP-Fc重组蛋白,并运用Western blot检测VIP-Fc的表达情况,运用考马斯亮蓝染色检测亲和层析的产物纯度;ELISA检测VIP和VIP-Fc在人血清中的衰减情况;对BALB/C小鼠进行滴鼻感染,运用qPCR检测VIP、VIP-Fc对RSV感染后Ⅰ型干扰素产生的影响;体外培养小鼠肺泡巨噬细胞系MH-S,运用qPCR检测VIP、VIP-Fc对RSV感染后Ⅰ型干扰素产生的影响;在RSV感染的肺泡巨噬细胞系MH-S中给予VIP-Fc干预,并转染RSV NS1质粒,感染后24H用qPCR检测IFN-β的表达水平;体外培养小鼠肺泡巨噬细胞系MH-S,进行RSV感染的同时予VIP-Fc处理,运用Western Blot检测Ⅰ型干扰素上游分子RIG-Ⅰ和其泛素化酶TRIM25和RNF135的蛋白表达水平;在RSV感染MH-S的同时进行VIP-Fc处理,