关键词:
假体周围骨溶解
磨损颗粒
GSK-3β
Hedgehog-Gli1信号通路
成骨细胞
摘要:
目的:假体周围骨溶解(Periprosthetic Osteolysis,PPO)和随后发生的无菌性松动(Aseptic Loosening,AL)是人工关节置换术后植入假体失效的主要原因。破骨细胞过度激活与局部异常炎症反应在PPO中的作用及机制已有广泛研究,而成骨细胞骨形成抑制在PPO中的作用及机制错综复杂,尚有待进一步阐明。转录因子Gli1是Hedgehog(Hh)信号通路的下游效应转录因子,研究表明,其参与了骨组织的胚胎发育与骨形成过程。而其是否参与磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解尚不明确。因此,我们以成骨细胞为切入点,拟探讨转录因子Gli1在磨损颗粒诱导的骨形成抑制中的作用及调控机制,明确Hh-Gli1信号通路在PPO疾病过程中的关键作用,以期为PPO的临床治疗提供新的潜在靶点。方法:利用扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope,SEM)对钛颗粒进行形貌表征分析。随后,分别在体外与体内实验中进行钛颗粒对成骨细胞骨形成的作用及机制探讨。在体外实验中,以小鼠胚胎成骨前体细胞(MC3T3-E1)为研究对象,建立体外钛颗粒干预成骨细胞分化模型,利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)、蛋白质免疫印迹实验(Western blot)和细胞免疫荧光染色等方法,观察成骨分化相关蛋白和Hh-Gli1信号通路下游转录因子Gli1的表达变化;通过细胞碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)和茜素红染色(Alizarin Red Staining,ARS)等方法,检测成骨细胞内碱性磷酸酶活性与体外骨矿化能力。同时,采用糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)特异性抑制剂TWS119和Gli1特异性抑制剂GANT58进行药物分组干预,再次检测上述指标的表达水平,综合探讨钛颗粒对成骨细胞分化与骨形成的作用及调控机制。在体内实验中,以C57BL/6小鼠为研究对象,建立体内小鼠颅骨骨溶解模型。按照随机数字表法分为假手术组(Sham组)、模型实验组(Vehicle 组)、TWS119(1 Omg/kg)和 TWS119(1 0mg/kg)联合 GANT58(20mg/kg)药物治疗组。术后第21天留取小鼠颅骨组织标本,进行微计算机断层扫描(Micro-CT)分析及三维重建,组织苏木精—伊红(Hematoxylin-Eosin,H&E)染色,马松三色(Masson)染色等方法进行体内效果验证和机制探讨。结果:SEM扫描结果显示,钛颗粒形貌为不规则形,粒径大小与假体磨损产生的颗粒相一致。在体外实验中,钛颗粒呈剂量依赖性下调MC3T3-E1细胞成骨分化过程中Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙蛋白(OCN)和成骨细胞特异性转录因子(Osterix)的蛋白表达,抑制碱性磷酸酶活性与体外骨矿化能力。同时,细胞内Gli1蛋白表达减少,核易位水平下降,Hh-Gli1信号通路被显著抑制。这一过程中,观察到GSK-3β的活性明显增强。抑制GSK-3β活性后发现,细胞内Gli1蛋白表达显著增加,核易位水平上升,Hh-Gli1信号通路被显著激活,同时伴随成骨细胞分化与骨矿化能力的明显增强。而抑制Gli1则显著逆转了这些变化。在体内实验中,TWS119药物治疗可显著减轻钛颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解,减轻局部纤维化程度,促进体内新骨形成;而这一治疗效果被联合GANT58治疗显著逆转。结论:我们的研究表明,钛颗粒干预通过调控Hh-Gli1信号通路抑制成骨细胞骨形成。机制上,钛颗粒通过上调成骨细胞分化过程中GSK-3β的活性,负调控Gli1导致Hh-Gli1信号通路下调。该项研究揭示了 GSK-3β调控Gli1在磨损颗粒诱导的骨形成抑制中的作用及机制,提示Hh-Gli1信号通路有望成为PPO的全新治疗靶点,为其临床转化和应用提供了理论基础。