关键词：
拟南芥
生长素
生长素极性运输
NPA
PIN1
摘要：
研究生长素的生物合成、极性运输、信号转导和代谢周转对深入理解植物生长发育的许多生理过程具有重要意义。萘基邻氨基苯甲酸（1-Naphthlphthalamic acid,NPA）作为植物学家长期使用的生长素极性运输抑制剂,被认为是研究生长素相关的植物生理反应的良好工具。NPA的应用推动了人们对生长素作用机制的理解和相关基因的挖掘。本研究利用对NPA超敏的拟南芥SAUR41（SMALL AUXIN UP RNA 41）过表达体,构建了筛选NPA低敏突变体的优良体系,通过基于二代测序的群体分离分析,定位到涉及生长素生物合成、极性运输和信号转导的基因位点,并初步探究了这些突变体抗NPA的分子机制,获得的主要结果如下:
***1的LRR结构域对其正常发挥受体功能具有重要意义。
我们的筛选体系鉴定到5个TIR1突变的低敏突变体。其中,OE-m2-1和OE-m2-2为提前出现终止密码子的无义突变,分别为W274*和W89*,OE-m2-3为已报道过的tir1-2突变体,OE-m2-4和OE-m2-5为单个氨基酸被替换的点突变,分别为G329D和G363R,都是各自LRR结构域的第一个氨基酸。TIR1具有18个LRR结构域,我们的筛选结果进一步表明,LRR结构域内的甘氨酸对TIR1整体构象的维持具有十分重要的作用,尤其是第一位的甘氨酸。甘氨酸的突变可能会导致其所在的LRR结构域发生重排,进而影响TIR1发挥生长素受体的功能。构建了TIR1/AFB基因家族的启动子报告株系,发现TIR1与AFB1在根冠中均有强烈的表达,与TIR1介导的生长素对根生长的抑制作用相一致。
***1-10和aux1-100突变体分别通过影响生长素的合成和内流来抗NPA。
ASB1编码生长素生物合成途径上游的关键酶,在asb1-10突变体中,根尖的生长素合成被减弱,NPA处理后,生长素在根尖的积累较少,并且主要聚集在静止中心与远端干细胞,导致生长素对根生长的抑制作用被减弱。AUX1编码生长素内流载体,在aux1-100突变体的根冠柱细胞中,向细胞内的生长素摄取减少,NPA处理后,生长素在柱细胞、侧根冠和中柱的积累相对较少,对根生长的抑制作用被减弱。
***1蛋白的P584位点是NPA结合的而非底物IAA结合的特异性位点。
PIN1的点突变体pin1P584L对NPA具有明显的抗性,转基因回补实验进一步验证了该突变体的NPA抗性是由PIN1的P584L点突变引起的。亚细胞定位观察发现P584L并没有改变PIN1蛋白的质膜定位。正常培养条件下,pin1P584L的根尖生长素分布模式与野生型基本相同,这可能暗示着PIN1蛋白运输生长素的能力并没有受到明显的影响,而NPA处理后,pin1P584L根尖静止中心的生长素浓度高峰仍然能够得到一定程度的维持,并且根尖中生长素的弥散范围更小。构建了PIN基因家族的启动子报告株系,发现质膜定位的PIN蛋白在根冠均有较强的表达,而内质网定位的PIN蛋白在根冠几乎无表达。
***可能通过调控Ca2+浓度来影响生长素的极性运输。
通过CRISPR/Cas9技术获得BIG基因的突变体,发现big突变体根冠柱细胞中的生长素浓度有轻微的降低,NPA处理后,滞留在根尖的生长素明显更少,进一步支持BIG调控生长素极性运输的观点。表型测量统计发现big突变体的主根长度,侧根数量,下胚轴长度,真叶大小明显削减,通过CYCB1;1-GUS染色以及根际酸化实验,发现big突变体的主根在细胞分裂和细胞膨大方面均存在缺陷,而这主要是由生长素的浓度梯度调控的。另外,big突变体的主根回环生长消失,观察发现big突变体根尖细胞胞质内的Ca2+浓度明显降低,而Ca2+能够调控PIN1的活性和极性分布来影响生长素运输的速率和方向。
综上,本研究发现,NPA在挖掘生长素相关基因方面仍然具有不可忽视的潜力,通过正向遗传学筛选NPA低敏突变体能进一步推动生长素的生物学研究。对本研究中筛选到的基因进行进一步的研究能使我们深入理解生长素生物合成、信号转导、极性运输等过程的内在联系。
