关键词：
创伤弧菌
全基因组测序
群体遗传学
功能基因组学
特异标签
摘要：
创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种嗜盐、革兰阴性、呈弯曲杆状、具有运动性的细菌,属于弧菌科弧菌属。该细菌天然存在于世界各地的沿海或河口水中,能够在易感人群中引发胃肠炎、原发性败血症和坏死性筋膜炎等疾病,特别是原发性败血症的病死率超过50%。据统计,创伤弧菌被认为是美国乃至全世界病死率最高的食源性病原菌之一,占美国所有海鲜相关死亡的95%,其感染的发病率仍持续上升,给公共卫生管理带来了巨大压力。创伤弧菌是一种具有高频重组特性的细菌,常发生同源重组,导致自然发生的突变位点与重组产生的变异位点混杂在一起,从而掩盖了创伤弧菌的基因水平转移信息和竖向遗传信号。本研究以创伤弧菌作为研究模型,开展了基于全基因组水平的群体遗传学研究,以便更好地掌握创伤弧菌的种群结构、遗传多样性基本特征、进化和传播规律等,这不仅有助于推动创伤弧菌的进化与溯源工作,还为具有高频重组特性的细菌进化研究提供了新思路。同时,本研究开展了基于全基因组水平的功能基因组学研究,以便更深入地了解创伤弧菌的毒力相关因子和特异序列标签识别,从而推动创伤弧菌感染的检测、防控、临床治疗等工作。本研究使用了分离自全球不同地区、不同时期的518株创伤弧菌分离株的全基因组序列进行分析,研究内容包括以下五个方面:(1)创伤弧菌的遗传多样性分析;(2)创伤弧菌的全基因组关联分析;(3)创伤弧菌的全基因组共适应图谱研究;(4)创伤弧菌生态群的表型实验分析;(5)特异序列标签识别研究。(1)创伤弧菌的遗传多样性分析:本研究利用大规模测序数据,基于核心基因组SNPs的系统发育分析软件,重新评估了创伤弧菌的种群结构和遗传多样性。结果显示,在纳入更多全基因组序列的情况下,我们鉴定到核心基因组SNPs为373704,且分离株两两之间的平均遗传距离(成对SNPs差异数量)为24403,表明全球的创伤弧菌具有非常高的遗传多样性。进一步的系统发育分析表明,世界各地的创伤弧菌首次被划分为六个系统发育谱系,并分别命名为L1～L6,且不同系统发育谱系的地理分布存在交叉重叠,呈现出相似的种群地理分布模式,我们认为,国际贸易等人类活动可能会打破创伤弧菌长久以来存在的跨洋传播阻碍,促进不同海域之间的创伤弧菌进行基因交流,而这最终会改变创伤弧菌的种群结构组成和进化模式。(2)创伤弧菌的全基因组关联分析:本研究利用两种全基因组关联分析的软件,对518条创伤弧菌分离株的全基因组序列与二分类表型(临床型和环境型)之间进行全基因组关联分析。结果显示,13个遗传因子与创伤弧菌临床株的致病性显著相关,其中11个基因为本研究新发现,例如,pgl A、gmr、mbt B、tyc C、yia V、dsb D、hsd R、YJ016＿00159、ram A、wbp A、cod A。这些新发现的显著性基因分别编码结构蛋白、黏附蛋白、信号蛋白、运输蛋白和代谢蛋白,参与细菌细胞壁和细胞膜的生物合成,调节细菌的黏附能力、信号转导系统、能量转运与代谢,维持细菌内部的氧化还原平衡,逃避宿主的防御机制,以及抵抗吞噬作用和血清介导的杀伤作用。(3)创伤弧菌的全基因组共适应图谱研究:本研究基于创伤弧菌的近完全网状种群结构,利用两种全基因共适应研究的软件,首次全面挖掘了创伤弧菌全基因组范围内(核心基因组和附属基因组)的共适应位点。结果发现了28508个共适应组,进一步划分为166个共适应网络,涉及34个核心基因(464个SNPs)和750个附属基因,大部分共适应发生在附属基因组变异间,仅有少部分共适应发生在核心基因组变异间。综合全基因组关联分析与全基因共适应研究的结果显示,6个遗传因子与创伤弧菌临床毒力或致病性显著相关,其中5个基因为本研究新发现,例如,gmr、yia V、dsb D、ram A、wbp A。这些基因分别编码结构蛋白、信号蛋白和代谢蛋白,参与细菌细胞壁和细胞膜的生物合成,调节细菌的信号转导系统,维持细菌内部的氧化还原平衡,逃避宿主的防御机制,以及抵抗吞噬作用和血清介导的杀伤作用。根据鉴定到的166个共适应网络及遗传元件的相互关系,本研究将共适应网络的发展归纳为四个阶段:偶然组合、半稳定、稳定和新物种形成。研究结果提示:细菌重组会受到自然选择的影响,为高频重组细菌的进化研究提供了新见解。同时,基于最大共适应网络的研究结果,全球的创伤弧菌首次被划分为两个可能存在不同生活方式的生态群(EG1和EG2)。(4)创伤弧菌生态群的表型实验分析:本研究针对两个生态群(EG1和EG2)的分离株开展了一系列表型实验,包括生长曲线测定、胁迫环境生存能力等,以探索不同生态群分离株在不同环境中的适应能力。结果显示,生态群EG2分离株在37℃、盐度、p H6-8、生物膜形成等多种条件下比生态群EG1分离株更具适应度优势,且来自两个生态群分离株具有不同的生态
