关键词：
染色体结构变异
NGS
染色体碎裂
Nanopore
摘要：
背景染色体结构变异,是染色体发生断裂后,断裂片段未在原位进行重接,而是移动位置与其他片段相接或者丢失,即异常重接,造成基因数目、位置或顺序发生改变。过去研究者常常认为染色体相互易位或倒位这两类染色体结构变异类型大多属于平衡性的结构变异,对基因组和个体发育一般无严重影响,不产生表型效应,然而,近30年的研究发现,约6.7%染色体相互易位或倒位携带者有智力障碍、先天畸形、发育迟缓、多器官受损等严重致愚、致残、甚至致死性的表型。由于此类患者颇为罕见,而患者之间存在较大的遗传异质性,导致大部分的患者致病原因不明,长期被误诊、漏诊,不能得到及时有效的治疗。因此精确定位染色体结构异常断裂点,深入分析序列和候选基因功能,对患者基因型-表型相关性分析及遗传学病因的研究,不仅有助于罕见病的精准诊断和咨询,更可以促进罕见病精准治疗和相关疾病药物的开发,具有极其重要的科学价值与临床意义。目的(1)以染色体平衡性结构变异伴异常表型的罕见病例为研究对象开展研究,探索复杂染色体结构变异衍生染色体重排及其断裂点分析技术体系;(2)运用第二代高通量全基因组测序、Bionano单分子光学图谱以及Nanopore单分子纳米孔测序等技术,精确定位染色体结构变异断裂点,通过生物信息学分析断裂点,结合患者基因型-表型相关性及断裂点基因功能,明确患者的遗传学病因诊断。方法(1)对前期收集的7例染色体平衡性结构变异伴智力障碍、发育迟缓、先天畸形等表型的罕见病例,通过第二代高通量全基因组测序、Bionano单分子光学图谱以及Nanopore单分子纳米孔测序等技术对病例g DNA进行测序,通过生物信息学分析,采用BWA-MEM将测序数据与人类基因组参考序列(GRCh37/hg19)比对,生成BAM文件,使用Breakdancer-1.45软件预测候选断裂点,并通过Integrative Genomic Viewer(IGV)软件进行可视化候选断裂点检查,Sanger测序验证断裂点,确定衍生染色体重排顺序,探索复杂染色体结构变异衍生染色体重排及其断裂点分析技术体系;(2)运用建立的技术体系,复苏罕见病例永生化淋巴细胞细胞株,扩增培养提取RNA,RT-PCR反转录形成c DNA,扩增候选断裂点片段后,采用Exo Sap纯化反应体系,使用Big Dye Terminater进行Sanger测序,精确定位病例染色体断裂点,通过PCR、q PCR、Hi-C检测、分析断裂点及上下游基因改变情况,对照患者基因型-表型相关性及断裂点基因功能,明确患者的遗传学病因诊断。结果(1)通过研究7例染色体平衡性结构变异伴异常表型罕见病例,初步建立复杂染色体结构变异衍生染色体重排及其断裂点分析技术体系;(2)运用建立的技术体系,对7例罕见病例开展遗传学病因研究,对1例典型PWS平衡易位病例,首次采用WGS测序方法精确定位易位断裂点,发现断裂点位于PWS的关键区域,而断裂点未打断区域内任何编码基因和小分子非编码RNA基因,仅打断host基因SNHG14引起表型,通过Hi-C分析断裂点结构域,推断致病原因可能是染色体断裂致所在区域基因结构域断裂;对1例初诊为Kabuki综合征的染色体碎裂复杂病例,采用WGS测序技术进行检测,未能明确重排衍生染色体序列,运用Nanopore长片段测序技术再次检测,本研究首次精准重排该例染色体碎裂病例衍生染色体重组片段(21个断裂点,14个片段),通过对病例表型精确查询,深入研究断裂点附近基因及缺失区域基因,根据患者基因型-表型相关性分析,明确诊断该患者为LGS合并Cd LS4症,纠正了患者初期诊断结果并明确了该病例的遗传学病因;对1例指甲发育不良病例,采用WGS测序方法精准定位倒位断裂点,位于KRT基因家族和KRTAP基因家族区域,对断裂点附近结构域进行分析,推断致病原因可能是倒位断裂引起基因排列顺序变化导致表型;对1例无精症病例,采用Bionano单分子光学图谱技术,精确定位断裂点打断AZFa区域上游,影响基因表达引起表型。结论(1)本研究首次建立了复杂染色体结构变异衍生染色体重排及其断裂点分析技术体系;(2)本研究运用技术体系,精确定位了7例染色体结构异常伴表型罕见病例的染色体断裂点信息,明确了4例遗传学病因;(3)第二代高通量全基因组测序、Bionano单分子光学图谱技术能够明确部分染色体结构异常病例断裂重排序列,但对于染色体碎裂等复杂性染色体结构变异病例则无法完成遗传学病因诊断,Nanopore长片段测序技术,因其阅读片段的长度优势,在染色体碎裂等复杂性染色体结构异常病例的诊断中优于二代测序技术。图32幅,表16个,参考文献93篇
