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关键词： 小麦   十倍体长穗偃麦草   抗条锈病   原位杂交   分子标记  

摘要： 十倍体长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum(Popd.)Barkworth and Dewey,2n=10x=70)是偃麦草属(Elytrigia)的一种多年生小麦野生近缘种植物,具有抗寒耐旱、耐盐碱、耐涝的生物特性,并且高抗小麦主要病害,是小麦遗传改良的理想基因源。通过远缘杂交将十倍体长穗偃麦草的优良基因转移到小麦,是拓宽小麦遗传基础的重要方式,本研究在小麦-十倍体长穗偃麦草杂交后代中筛选到两份抗条锈病的衍生系CH18067和CH20015,利用分子细胞遗传学研究方法对其进行了综合鉴定,主要研究结果如下:(1)根尖体细胞观察结果显示CH18067的染色体数目为42;花粉母细胞观察结果显示CH18067减数分裂中期Ⅰ的染色体构型为2n=21Ⅱ,在减数分裂后期Ⅰ染色体均等分离,具有遗传稳定性。FISH和GISH鉴定出CH18067的2D和4D染色体缺失,同时含有2对十倍体长穗偃麦草染色体;Mc-GISH鉴定表明这2对染色体分别归属于J基因组和J基因组。在分子标记分析中,位于第二部分同源群和第四部分同源群的6个多态性标记在CH18067中扩增出了十倍体长穗偃麦草特异性条带。CH495-2是CH18067和普通小麦阿勃的杂交后代,通过原位杂交和分子标记分析鉴定出CH495-2含有一对2J染色体,得以明确CH18067中J基因组染色体归属于第二同源群,而J基因组归属于第四同源群。在小麦-二倍体长穗偃麦草液相芯片(Geno Baits?Wheatplus EE)检测中,CH18067在2D和4D染色体上的信号缺失,同时在2E和4E染色体上信号显著富集。综合鉴定结果,确定CH18067为小麦-十倍体长穗偃麦草2J(2D)+4J(4D)的双重异代换系,并获得了Oligo-p Ta535探针下2J和4J染色体的FISH核型。CH18067在成株期对条锈病表现为免疫,且具有矮杆、长粒的相关性状,有进一步利用的潜力。(2)细胞学观察结果显示CH20015的体细胞染色体数目为44条,花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ包含22对二价体,在减数分裂后期Ⅰ染色体能够均等分离,具有遗传稳定性。原位杂交鉴定确认CH20015含有40条普通小麦染色体,一对2A染色体缺失,同时拥有2对来自十倍体长穗偃麦草的J基因组染色体。分子标记分析结果显示,位于第二部分同源群和第六部分同源群的9个多态性标记在CH20015中扩增出了十倍体长穗偃麦草特异性条带。在小麦-二倍体长穗偃麦草液相芯片(Geno Baits?Wheatplus EE)检测中,CH20015在2A染色体上信号缺失,同时在2E和6E染色体上信号显著富集。综合鉴定结果,确认CH20015中2J染色体代换了2A染色体,同时附加了一对6J染色体,其为小麦-十倍体长穗偃麦草2J(2A)+6J异附加代换系。通过对比CH18067中2J染色体的FISH核型,进一步确定了6J染色体在Oligo-p Ta535探针下形成的杂交信号。在抗病性鉴定中,CH20015对条锈病表现为高抗,可以进一步创制易位系或渐渗系加以利用。经综合鉴定明确了CH18067和CH20015的遗传组成,为小麦抗病育种和遗传研究提供了候选种质材料。

关键词： 产前诊断   先天性心脏病   全外显子组测序   AXIN2  

摘要： 目的:先天性心脏病（Congenital heart disease,CHD）是最常见的出生缺陷,占所有先天性畸形的近三分之一,也是围产期婴儿死亡的主要原因。由于基因型和表型的异质性,以及较低的外显度,CHD的产前分子遗传学诊断存在一定的挑战性。本研究旨在利用全外显子组测序（Whole exome sequencing,WES）技术对核型和染色体微阵列分析结果均为阴性的先心病胎儿进行相关致病基因检测,以评估其在产前诊断中的临床价值,为该疾病的预防、早期诊断和临床管理奠定基础。此外,本研究还将构建基因突变小鼠模型,从动物水平进一步探索胎儿心脏发育异常相关基因的致病机制,从而为研究先心病的发病机制提供科学依据。方法:1、选取2018年1月至2020年12月期间在广州市妇女儿童医疗中心产前诊断中心就诊,超声心动图提示为CHD并行侵入性产前诊断的胎儿病例为研究对象。根据孕妇的知情同意,对所有核型和染色体微阵列分析结果均为阴性的88例胎儿及其父母样本（核心家系）进一步行WES检测。将先天性心脏病分为孤立性先天性心脏病和非孤立性先天性心脏病。2、对筛选到的候选基因位点AXIN2 c.863G>C（p.G288A）进行生物信息学软件预测,使用Swiss Pdb Viewer软件分别对野生型蛋白和突变株进行同源建模分析。3、构建AXIN2基因突变小鼠模型,通过心脏超声和病理切片分别从影像学和形态学探讨突变对小鼠心脏表型的影响。4、使用q RT-PCR和Western blot技术检测突变小鼠心脏组织中AXIN2的表达水平,以及经典Wnt信号通路中β-catenin和下游关键分子TCF4的表达情况,探讨AXIN2基因缺陷对Wnt/β-catenin信号通路的影响。结果:1、在使用核型和染色体微阵列分析技术的基础上,WES能进一步提高约10.2%（9/88）的产前CHD病因检出率。2、WES在非孤立性先心病病例中的阳性诊断率高达14.8%（4/27）,高于孤立性CHD病例中8.2%（5/61）的检出。3、AXIN蛋白G288位点在生物进化过程中高度保守,通过同源建模分析发现AXIN蛋白第288位氨基酸由甘氨酸变为丙氨酸后,新形成两个氢键,改变了AXIN蛋白的整体稳定性。4、成功构建AXIN2杂合突变小鼠模型,通过心脏超声检查发现杂合子小鼠心脏射血分数和缩短分数均明显下降,表明突变组小鼠心脏收缩和舒张功能降低。5、Masson染色结果显示野生对照组小鼠心肌纤维排列规则,而杂合子小鼠心室部位出现结构紊乱的纤维组织,胶原沉积,纤维化异常。6、AXIN2杂合突变可使小鼠心脏组织中AXIN2的表达水平显著降低,能够上调经典WNT信号通路中的β-catenin和TCF4的表达（P<0.05）。结论:1、对于传统染色体核型和染色体微阵列分析技术检测结果均为阴性的先心病胎儿,WES可以额外提高遗传病分子诊断率,进一步验证了WES技术在产前CHD胎儿中的应用价值。同时,这也提示CHD与单基因缺陷之间存在一定的相关性,尤其是在合并有心外其他异常的病例中。2、AXIN2基因缺陷影响了经典Wnt信号通路中关键因子和下游靶基因的表达水平,为进一步探讨AXIN2基因缺陷介导Wnt/β-catenin信号通路导致CHD提供了一定的理论参考。

关键词： 水稻害虫   染色水平基因组组装   剂量补偿   比较基因组   群体遗传学  

摘要： 水稻作为全球一半以上人口的主要粮食,在生产中却遭受着许多害虫为害。为了更好地研究这些水稻害虫爆发成灾的分子机制,对害虫进行更有效的防控治理,需要这些物种的全基因组遗传信息。取食水稻的昆虫绝大部分物种的基因组遗传信息依然未知,不仅如此,已经报道的基因组质量也良莠不齐,此外,如何利用好这些基因组信息进行更多的生物学特征相关的遗传机制分析也需要进一步探索。本文利用高通量测序技术,围绕三种水稻吸汁害虫灰飞虱、稻蓟马、褐飞虱的基因组开展了研究,所得主要结论如下:1)通过使用ONT和Hi-C技术,组装了一个染色体版本的灰飞虱Laodelphax striatellus基因组。对来自不同组织的16个样品进行RNA-seq测序,以进行基因组注释和基因剂量补偿的分析。最终获得了一个510.2Mb大小的基因组,将99.12%的scaffolds组装到了15条染色体上(包括14条常染色体和1条X染色体),注释到了16160个蛋白编码基因。此外,发现在灰飞虱不同体组织中都存在着完全剂量补偿,但在生殖腺精巢中缺乏剂量补偿。还发现,在所有组织中,雌性偏向基因都显著的富集到X染色体上,而性腺组织中,雄虫偏向的基因富集到常染色体上。2)结合多种测序数据,包括Pac Bio,Illumina和Hi-C,组装了水稻寡食性吸汁害虫稻蓟马Stenchaetothrips biformis的染色体版本基因组,获得了一个338.86Mb的基因组,scaffold N50为18.21Mb,注释到17167个蛋白编码基因和36.25%的重复序列。与另两种多食性蓟马,西花蓟马Frankliniella occidentalis和棕榈蓟马Thrips palmi进行比较基因组分析,发现在稻蓟马中,化学感受相关的基因家族GRs、ORs和IRs均收缩,反映出稻蓟马较小的寄主范围,而与压力反应和羧酸胆碱酯酶(CCEs)中与饮食/解毒相关的进化枝的基因家族得到扩张,可能与对水稻的适应性相关。在多食性的西花蓟马和棕榈蓟马中,发现扩张的基因家族富集到的功能与富含芳香族和含花青素的化合物代谢,以及对病毒和细菌免疫相关,与这两种害虫食花、食果的食性,以及传播病毒、内共生菌方面的特性相关。3)对采自全球的358头褐飞虱Nilaparvata lugens进行全基因组重测序,从遗传学上揭示了这种小型迁飞害虫的全球的迁飞和扩散路径。将全球褐飞虱分为3个迁飞群体和3个本地群体,表明迁飞行为在塑造种群结构中的重要作用。此外,发现只有东亚的种群在中南半岛和远东之间形成一个完整的迁飞闭环,不同于东南亚和南亚种群只分别向中南半岛进行单向迁入。此外,这些主动的迁飞的群体独特的进化区域位于一条不论在褐飞虱种群之间,还是在近缘物种间都高度分化的染色体上。还发现杀虫剂的抗性等位基因更有可能在选择放松时产生,这些位点的进化受到杀虫剂使用的影响,比迁飞带来的影响更大。本研究组装了高质量的灰飞虱和稻蓟马的基因组,为更好地了解半翅目昆虫的性别调控网络、进一步研究蓟马的进化与害虫管理提供了基础。特别是本研究加深了对于季节性迁飞小型昆虫是如何促进物种的进化和分化过程的理解,提供了更多的基因组资源用于褐飞虱的管理和早期的预警。

关键词： 中间偃麦草   普通小麦   杂种后代   选育   原位杂交  

摘要： 中间偃麦草(Thinopyrum intermedium,2n=6x=42,JJJJSt St或EEEESt St)是小麦重要的近缘植物之一,拥有出色的抗病、耐寒、耐旱、耐盐碱等特性,具有很强的环境适应能力。利用远缘杂交将中间偃麦草的优异基因导入普通小麦中,可以创造小麦新的变异类型、扩宽小麦遗传基础、提高小麦各方面的适应能力、改良小麦的品质,是创新小麦育种资源的重要方向之一。本研究综合利用形态学观察以及GISH、FISH、SDS-PAGE等技术,对14个小偃麦衍生系及亲本材料进行农艺性状、染色体核型以及HMW-GS组成等方面的分析,从中筛选出综合性状优良且遗传基础稳定的小偃麦衍生系材料,为其后续的有效利用提供依据。主要结果如下:(1)明确了14个小偃麦种质系的农艺性状特点,其中7个小偃麦衍生系种质W281、W282、W283、W284、W287、W288、W290的田间性状表现良好,可作为优异种质资源用于小麦遗传改良。(2)利用分子细胞遗传学技术,明确小偃麦W277和W279为双体异附加系,并推断二者均附加了1对1St-J外源染色体。二者之间存在FISH带型差异,主要分布在3A、4A、2B、7B等染色体上,由此导致株高、穗长等主要农艺性状不同。因此,说明它们是不同的异附加系。结果表明6个小偃麦W285、W286、W287、W288、W289、W290为小麦-中间偃麦草渐渗系。虽然在GISH中无明显外源信号,但与双亲的FISH核型均存在差异,推测是由于中间偃麦草外源染色体片段的渗入导致。其余6个种质材料W278、W280、W281、W282、W283、W284为1RS·1BL易位系。(3)利用SDS-PAGE分析了不同种质材料的HMW-GS组成,种质W278和W280的HMW-GS组成为(1,14+15,5+10),W277、W279和W281的HMW-GS组成为(1,7+9,2+12)。其中,W278和W280的5个亚基均为优质亚基,可作为携带优质HMW-GS的种质资源应用于小麦育种,改善小麦品质。

关键词： 遗传学实验   羊水细胞培养   染色体核型分析   教学改革  

摘要： 随着我国国民经济的快速发展，人们迎来了改革发展新时代。近年来，国家对高等教育人才培养模式提出了更高的要求，高等院校需培养创新型和全面发展的综合型人才，以满足时代发展的需求。遗传学是研究生物遗传与变异的一门科学，随着高通量测序技术的快速发展，生物遗传学成为近年来发展最快速的学科之一[1]。

关键词： 转座子   Helitron   体细胞剪切   剪切-粘贴转座   滚环复制  

摘要： Helitron是通过计算分析手段发现后经实验验证广泛存在于动植物和真菌基因组中的DNA转座子新类型。长久以来,数目可观的Helitron因缺乏经典转座子的特征序列,如末端反向重复(Terminal Inverted Repeats,TIR)和靶位点重复(Target Site Duplication,TSD)等,而难以被发现或准确鉴定。另外,Helitron不同于经典DNA转座子,其转座反应可能通过滚环复制(rolling-circle-replication,RCR)和剪切粘贴(cut-and-paste)两种机制来完成。而充分展示这两种转座机制亟待克隆植物中未见报道的自主性Helitron(autonomous Helitron,a Hel)转座子。玉米基因组中Helitron转座子的数量、类别和占比都极为突出,表明玉米中可能存在具有较高转座遗传活性的a Hel转座子。本研究旨在构建玉米Helitron转座子转座活性报告系统、鉴定这些系统的功效,并在不同玉米自交系中克隆使带有标记的非自主性Helitron(defective Helitron,d Hel)发生转座的遗传位点,由此阐明玉米a Hel转座子的基因结构以及调控Helitron发生转座的遗传机制。本研究构建的玉米Helitron转座子转座活性检测报告系统中,参与玉米籽粒糊粉层细胞花青素合成途径的C1(Colored aleurone 1)基因的启动子区域插入了带有绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)标记的d Hel转座子。通过转基因株系与70多个涵盖广泛遗传背景的玉米自交系杂交,充分利用玉米自交系中丰富的遗传多样性来鉴定并克隆玉米的a Hel转座子,进而揭示其精细分子结构、滚环复制或剪切粘贴等可能的转座机制、原初插入位点序列转座后修复模式和新插入位点的序列偏好性等遗传特征,最终为应用Helitron转座子进行基因组工程编辑提供理论基础、研究方案及技术手段。主要结果如下:1.通过同源比对在已报道过的非自主性Helitron中甄别出四类拷贝数高或近期监测到转座事件的d Hel:Hel1-4、Hel1613、Hel1158、Hel A2,分别截取5’和3’末端长度相近的末端保守序列作为报告基因GFP的侧翼序列共同构成非自主性的d Hel-GFP转座系统。参照有关C1基因启动子区功能分析报道,选择四个位点(S1、S2、S3、S4)作为d Hel-GFP的起始插入位点。上述各类d Hel-GFP遗传转化材料经与不同玉米自交系杂交,在相应的后代籽粒中监测到预期的紫色斑点表型,同时发现不同d Hel插入同一位点的转基因品系表型各异,相同d Hel在不同整合位点的表型亦不尽相同。分子检测试验表明启动子区的d Hel插入并未引起C1基因的完全丧失,在杂交后代籽粒中出现完全紫色与无色的分离表型。***实验检测发现各转基因系幼苗叶片中存在丰富的可变剪接C1转录本。来源于不同转基因载体的不同d Hel在目的基因启动子和外显子部位的插入都可以导致C1转基因拷贝在宿主中出现序列组成各异的转录本剪接体,并且特定插入位点的特定d Hel插入还会导致转基因拷贝在宿主中产生多种可变剪切嵌合转录本。该结果表明,C1基因启动子区域的d Hel-GFP插入极有可能是宿主基因在转录中产生序列组成多样的可变剪接体的直接原因,进而丰富了转座子参与基因表达调控的新途径。3.尽管在大多数转基因株系中尚未检测到d Hel-GFP发生剪切转座的简易体细胞修复产物,但是在部分转基因系(S3-Hel A2、S3-Hel1158、S1-Hel1-4、S4-Hel1-4)和测试系的杂交F代(T×c1测试系)的幼叶中可以检测到d Hel-GFP发生剪切转座后的精确修复产物,表明在该测试系中可能存在a Hel,同时还表明这几类d Hel可以通过“剪切粘贴”模式(cut-and-paste)发生转座。4.为了检测d Hel-GFP是否同时可以通过滚环复制模式进行转座,本研究以检测到剪切转座的转基因材料基因组DNA为模版,采用巢式PCR技术扩增滚环复制中较为常见的环状中间产物。结果显示,在发生转基因d Hel精确剪切转座的遗传材料中未检测到环状d Hel-GFP对应的PCR扩增产物,表明d Hel-GFP的主要转座中间产物可能并非环状结构,因此“滚环复制”模式有可能并不是采取“剪切粘贴”模式的转座子类型同时采取的另一转座模式。综上所述,本研究创制的报告系统以玉米为研究对象开创性地探索克隆植物中尚未见报道的a Hel转座子,分子检测和遗传分析表明,本研究体系中d Hel自身的序列组成和插入位点所在宿主基因的序列结构都可以对各类d Hel剪切转座的活性产生影响,同时还引起转化后宿主基因转录水平

关键词： 男性不育症   梗阻性无精症   精子鞭毛形态多发异常   受精障碍   全外显子测序   男性不育症   梗阻性无精症   单精子卵母细胞胞浆注射   全外显子测序   CFTR基因   男性不育症   精子鞭毛形态多发异常   单精子卵母细胞胞浆注射   全外显子测序   男性不育症   受精障碍   人工卵子激活   全外显子测序   PLCZ1基因  

摘要： 目的:探究先天性梗阻性无精症(obstructive azoospermia,OA)、精子鞭毛形态多发异常(multiple morphological abnormalities of the sperm flagella,MMAF)以及精源性受精障碍三类男性不育症的遗传学病因,初步探究其致病机制,并系统比较分析其临床结局和治疗策略。方法:本研究为单中心回顾性队列研究,纳入本中心于2018年1月至2022年12月的经全外显子测序(whole-exome sequencing,WES)的男性不育症患者,根据其临床表现分为先天性OA、MMAF以及精源性受精障碍三大类。通过Sanger测序对上述不育症患者的遗传学病因进行确认,并通过生物信息学分析工具和分子生物学技术分析突变位点的致病性。接着分析比较携带CFTR基因突变对先天性OA患者临床结局的影响,以及MMAF表型对患者临床结局的影响。此外,在反复受精障碍患者中评估基于离子霉素和放线菌酮的新型人工卵子激活(artificial oocyte activation,AOA)技术的有效性和安全性。结果:第一部分收集了 38例行WES检测的先天性OA患者,携带20种CFTR基因突变,其中6种为新发突变。患者的CFTR基因突变位点呈高度异质性,除IVS9-5T突变外无“高频位点”。携带2种CFTR基因突变并不会影响OA患者的胚胎实验室结局、胚胎临床结局以及新生儿结局。第二部分共收集38例临床表型为MMAF的男性不育症患者,23例行WES检查,其中10例有明确遗传学病因,包括DNAH1、CFAP43、FSIP2以及SPEF2基因。DNAH1基因突变患者精子存在鞭毛轴丝中央微管组装异常,但免疫荧光染色显示MMAF患者精子顶体形态正常且患者经ICSI治疗后可成功受孕。经倾向性评分匹配基线后,MMAF患者相较同期的少弱精患者胚胎实验室结局较差,但MMAF表型不会影响最终的临床结局和新生儿结局。第三部分共收集了 3例PLCZ1基因突变的患者和2例ACTL7A基因突变的患者。ACTL7A基因突变可能会引起精子头部PLCζ1蛋白的表达异常同时影响顶体功能。此外还收集了 6例ICSI受精失败且传统AOA无效的患者,在经新型AOA技术处理后,患者的受精率明显提高,且能发育为形态和核型均正常的囊胚。结论:CFTR基因突变是先天性OA的常见遗传学病因,但不会影响OA患者的临床结局;MMAF表型有多种致病基因,ICSI能帮助MMAF患者成功妊娠,但胚胎发育情况会受损。PLCZ1和ACTL7A基因突变均为精源性受精障碍的遗传学病因,基于离子霉素和放线菌酮的新型AOA技术对于受精失败的患者有较好的有效性和安全性。本研究为男性不育症的遗传学病因诊断及其治疗策略的制定提供了理论支持和数据支持。第一部分:先天性梗阻性无精症的遗传学病因及妊娠结局分析目的:进行先天性梗阻性无精症(obstructive azoospermia,OA)患者的流行病学调查,筛查先天性OA相关的致病基因和有害突变,并追溯其妊娠结局。方法:本研究为单中心回顾性队列研究,纳入本中心于2018年1月至2022年12月于本中心就诊的行全外显子测序的无精症患者,调查了其中先天性OA患者的精液常规、性激素及精浆生化结果,分析了先天性OA患者携带的CFTR(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)基因突变情况,并进行了突变位点的功能预测。接着根据患者携带CFTR基因突变位点的数目,分析比较了携带2个CFTR基因突变位点的先天性OA患者和其他先天性OA患者两组间的临床基线指标、胚胎实验室结局、胚胎临床结局以及新生儿结局。结果:共纳入了 59例无精症患者,其中先天性OA患者38例。先天性OA患者的精液大多呈酸性且精液量偏小,精浆中性α-葡糖苷酶和果糖也偏低。在先天性OA患者中,24名患者(63.2%)携带CFTR基因突变位点。所有患者共携带41个CFTR基因突变位点,共20种类型,其中6种为新发突变,平均发生频率为1.71个/人,其中发生频率最高的突变位点为c.1210-12T[5]-c.1210-34TG[13](29.3%,12/41)。携带2个CFTR基因突变位点的先天性OA患者(n=17)和其他的先天性OA患者(n=21)的临床基线指标无明显差异,经附睾精子抽吸术(percutaneous epididymal sperm aspiration,PESA)单精子卵母细胞胞浆注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)助孕后,两组间的胚胎实验室结局、胚胎临床结局以及新生儿结局也均无统计学差异。结论:在中国人群中CFTR基因的遗传突变模式与白种人的CFTR基因

关键词： 帕金森病   运动障碍疾病   NOTCH2NLC   分子遗传学   致病机制  

摘要： 背景　　帕金森病(Parkinson''sdisease，PD)是一类常见的神经系统退行性疾病，主要临床表现为运动迟缓、震颤及肌强直，主要病理表现为黑质多巴胺能神经元的变性死亡。大多数患者为散发性，少数为基因突变引起的遗传性帕金森病。目前，相当部分基因变异导致帕金森病/帕金森综合征的分子机制尚不明确。研究发现，人类特有的NOTCH2NLC基因5''非翻译区的GGC重复扩增突变与神经元核内包涵体病(Neuronalintranuclearinclusiondisease，NIID)的发生相关。部分携带NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变的NIID患者可合并锥体外系表现，且部分家族性NIID患者可表现为以帕金森综合征为主的临床表型，提示NOTCH2NLC基因的GGC重复扩增突变可能与帕金森病/帕金森综合征关系密切。　　目的　　本研究拟在中国汉族人群帕金森病、帕金森综合征患者队列中探索NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变与帕金森病/帕金森综合征的关系，并通过NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变阳性患者来源的iPSC细胞系分化的3D类脑器官模型及2D神经元模型，结合转染不同次数NOTCH2NLC基因特异性GGC重复扩增突变质粒的细胞模型，共同探讨NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变导致帕金森病/帕金森综合征的可能致病机制。　　方法　　1纳入1011例原发性帕金森病患者、26例帕金森综合征患者及1134例正常对照，筛选NOTCH2NLC基因的GGC重复扩增突变，探讨NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变与中国汉族人群帕金森病/帕金森综合征的关系;2对比携带不同次数范围GGC重复扩增突变的帕金森病患者及帕金森综合征患者的临床、影像、病理表现及重复序列中各重复单元的占比;3构建含20、50、90次GGC重复的NOTCH2NLC基因特异性质粒，及表达上述质粒的细胞模型，探讨不同次数NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变编码蛋白在细胞中的分布差异;4运用上述细胞模型，探讨不同GGC重复次数对细胞核内包涵体形成、自噬、核仁应激、核糖体生成、应激颗粒形成及全细胞蛋白合成的影响;5运用上述细胞模型，结合免疫共沉淀及蛋白质谱，探索不同次数NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变编码蛋白的高亲和蛋白;6利用NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变阳性（≥90次）帕金森综合征表型NIID患者的皮肤成纤维细胞，重编程为iPSC细胞系，并进一步分化为患者来源的2D神经元模型;7运用上述构建的NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变阳性（≥90次）帕金森综合征表型NIID患者来源的2D神经元模型及实验室已构建的同患者来源的3D类脑器官模型，探讨NOTCH2NLC基因90次及以上的GGC重复扩增突变对核内包涵体形成、NOTCH2NL表达、自噬及整合应激反应的影响;8运用上述构建的NOTCH2NLC基因GGC重复扩增突变阳性（≥90次）帕金森综合征表型NIID患者来源的2D神经元模型，结合bulkRNA测序，探讨NOTCH2NLC基因90次及以上的GGC重复扩增突变可能的致病机制。　　结果　　1发现4例帕金森综合征患者携带NOTCH2NLC基因90次及以上的GGC重复扩增突变，11例帕金森病患者携带41-60次的GGC重复扩增突变，未发现正常对照携带超过40次的GGC重复扩增突变。统计分析示NOTCH2NLC基因90次及以上的GGC重复扩增突变与帕金森综合征有关，而41-60次的GGC重复扩增突变与帕金森病有关;2携带NOTCH2NLC基因90次及以上GGC重复扩增突变的帕金森综合征患者临床上可合并严重的认知障碍及自主神经功能障碍，影像上可表现为DWI皮髓交界处高信号及不同程度的脑白质病变，皮肤病理示泛素染色阳性的核内包涵体沉积;携带41-60次GGC重复扩增突变的帕金森病患者临床表现为典型的帕金森病，影像上不合并上述表现，皮肤病理示磷酸化的α-突触核蛋白沉积;重复序列中，携带41-60次GGC重复扩增突变的帕金森病患者较携带90次及以上GGC重复扩增突变的帕金森综合征患者示更高的GGC占比;3成功构建含20、50、90次GGC重复的NOTCH2NLC基因特异性质粒及表达上述质粒的细胞模型。在细胞模型中，90次GGC重复扩增突变的编码蛋白示聚集性分布，而20、50次GGC重复扩增的编码蛋白未见聚集;4在细胞模型中，NOTCH2NLC基因90次的GGC重复扩增突变可编码含90次多聚甘氨酸（polyG）的蛋白，参与核内包涵体的形成。90次的GGC重复扩增突变可刺激增强细胞的自噬、核仁应激、应激颗粒形成水平，损伤核糖体生成及全细胞蛋白合成过程。50次的GGC重复扩增突变对上述指标的影响不明显;5蛋白质谱结合亲和性分析示，与NOTCH2NLC基因50、9

关键词： 食管癌   L3MBTL4基因   表观遗传学   生物学功能  

摘要： 食管癌(Esophageal cancer)发病率全球排名第7位，死亡率排名第6位，中国的食管癌发病和死亡负担占到全球近一半。食管癌早期症状不典型，多数患者就诊时已属中晚期。食管癌具有高度的侵袭性，目前的主要治疗手段是手术、化疗与放疗，但效果并不令人满意。其主要原因是食管癌的发生和发展机制不明确，亟需深入研究其发病机制，获得早期诊断、治疗和早期预防的新策略。表观遗传调控在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用，其中抑癌基因表观遗传沉默是促进肿瘤进展的重要机制。肿瘤的发生和个体发育在许多生物学行为方面非常相似。MBT(Malignant Brain Tumor)结构域在黑腹果蝇癌变的基因筛选中被发现，MBT结构域是一个“染色质阅读器”，具有MBT结构域的蛋白通过压缩染色质而抑制靶基因转录，在发育和肿瘤抑制方面具有关键作用。既往研究报道L3MBTL1、L3MBTL2、L3MBTL3均参与DNA损伤修复。L3MBTL4是该基因家族中的一个新成员，位于人18号染色体短臂(18p)。L3MBTL4在食管癌中的表观遗传改变和功能机制尚缺乏研究。　　目的：　　探究L3MBTL4在食管癌中的表观遗传调控机制。分析L3MBTL4甲基化能否成为食管癌早期诊断、预后和化疗敏感性的生物标志物。研究L3MBTL4在食管癌中的生物学功能。探究L3MBTL4是否参与DNA损伤修复，及L3MBTL4甲基化作为食管癌“协同致死”治疗标志物的可能性。　　方法：　　(1)本课题纳入8种食管癌细胞系、60例正常食管黏膜上皮组织、65例食管不典型增生组织和1054例原发性食管癌组织。使用RT-PCR、甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)、亚硫酸盐测序(Bisulfite Sequencing,BSSQ)技术检测L3MBTL4在食管癌中的表达和甲基化情况。应用去甲基化药物5-氮杂-2''-脱氧胞苷(5-aza-2''-deoxycytidine,5-aza)处理细胞，以明确L3MBTL4在食管癌细胞系中的表达是否受甲基化调控。结合临床病理参数，分析其甲基化与年龄、性别、肿瘤分期、分级和分化的相关性。　　(2)使用TCGA和GTEx数据库分析L3MBTL4在食管癌和癌旁组织中的mRNA表达水平，并在食管癌组织中分析DNA甲基化与表达水平的相关性。使用免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)技术检测L3MBTL4在食管癌组织中的蛋白表达水平。　　(3)使用慢病毒和CRISPR/Cas9基因敲除技术构建L3MBTL4过表达和敲除细胞模型，使用MTT和克隆形成实验检测L3MBTL4对食管癌细胞增殖能力的影响，流式细胞术检测L3MBTL4对食管癌细胞周期和凋亡的影响。　　(4)使用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)联合质谱分析(Mass Spectrometry,MS)鉴定L3MBTL4相互作用蛋白，并通过Western blot验证。通过彗星实验验证L3MBTL4是否参与DNA损伤修复。通过Western blot检测L3MBTL4对 ATM/CHK2,ATR/CHK1 和 DNAPK/XRCC4 信号通路的影响。　　(5)通过药物敏感性(Inhibitory Concentration 50％,IC50)实验检测 L3MBTL4对顺铂(Cisplatin)和DNAPK抑制剂(NU7441)的敏感性影响，探讨L3MBTL4甲基化作为食管癌协同致死治疗标志物的可能性。　　结果：　　(1)RT-PCR结果显示L3MBTL4在KYSE30和KYSE150中缺失表达，在KYSE140、KYSE180 中表达水平降低，在 KYSE450、KYSE520、TE1 和 YES2 中高表达。MSP结果显示，在KYSE30和KYSE150中L3MBTL4启动子区呈完全甲基化，在 KYSE180 和 YES2 中为非甲基化，在 KYSE140、KYSE450、KYSE520、TE1细胞系中呈部分甲基化，表明L3MBTL4表达水平与其启动子区甲基化状态相对应。应用BSSQ进一步验证了 L3MBTL4在KYSE30和KYSE150中完全甲基化，在KYSE180和YES2中为非甲基化，并显示其CpG位点的甲基化密度。应用5-aza处理后，原来高表达的细胞株表达未发生明显变化，低表达的细胞株表达水平升高,缺失表达的细胞恢复表达，表明L3MBTL4的表达受启动子区甲基化调控。　　(2)TCGA和GTEx数据库分析显示，L3MBTL4在食管癌组织中的表达水平低于癌旁组织，在食管癌组织中其启动子区甲基化与mRNA表达水平呈负相关，进一步提示L3MBTL4在食管癌组织中的表达可能受甲基化调控。应用L3MBTL4的甲基化引物

关键词： 初次自然流产   胚胎染色体检测   夫妻染色体核型检测  

摘要： 自然流产(Spontaneous abortion,SA)指自然条件下(非医源性)妊娠不足28周、胎儿体重不足1000g而终止者，与同一配偶发生连续2次及以上流产为复发性流产(Recurrent spontaneous abortion,RSA)。据统计，约15％-25％的女性一生中会发生至少1次流产，对患者身心、家庭及社会造成极大影响。自然流产的原因复杂，包括遗传因素、环境因素、母体因素和其他因素，其中胚胎染色体异常占40％～60％,部分可由夫妻染色体异常导致。目前对于流产几次需要进行胚胎遗传学检测并进一步行夫妻双方染色体的检查，国内外尚无统一标准，2017年欧洲人类生殖及胚胎学会(European Society of Human Reproduction and Embryology,ESHRE)、2018年美国妇产科医师学会(American College of Obstetricians and Gynecologists,ACOG)等指南指出不推荐常规行流产物遗传学筛查及夫妻染色体核型分析，国内2020年自然流产诊治中国专家共识倾向于对复发性流产患者才行胚胎及夫妻双方染色体检查，一些研究显示初次流产与复发性流产胚胎染色体异常率及夫妻染色体核型异常率无明显差异，是否初次流产行染色体相关检查仍需进一步研究。当前我国出生人口数持续降低，对于具有生育意愿，但出现自然流产夫妇的生育力的保存就成为一项重要的课题，本研究通过对胚胎及夫妻染色体异常的遗传学分析探索自然流产患者进行胚胎染色体检测的时机，以及胚胎染色体异常时，行夫妻染色体核型检测的临床策略，为自然流产夫妇的遗传学检测方案提供依据，最大限度实现生育力保存。　　目的：　　探索初次自然流产患者进行胚胎染色体检测和夫妻染色体核型检测的临床价值和路径。　　方法：　　选择2019年1月-2022年12月于郑州大学第三附属医院产前诊断中心因自然流产行胚胎低深度全基因组测序(Copy number variation sequencing,CNV-seq)检测者1519例，分为初次流产组745例和复发性流产组774例，比较两组胚胎染色体的异常率及其分布。将其中因胚胎染色体异常行夫妻染色体核型检测患者361例分为初次流产组193例和复发性流产组168例，比较两组夫妻染色体异常占比。进一步比较胚胎发生不同类型遗传学异常时夫妻染色体核型异常的检出率，分析临床所见自然流产胚胎染色体异常与夫妻染色体核型异常的相关性，比较胚胎发生不同类型遗传学异常行夫妻染色体核型检测检出存在夫妻遗传学异常的灵敏度、特异度及诊断效果。　　所有统计分析均使用SPSS26.0软件进行。计数资料采用频数及率进行描述,组间差异使用卡方检验、校正卡方检验或Fisher精确检验进行比较。使用ROC曲线分析不同检测方案的诊断效果。P＜0.05被认为差异具有统计学意义，四组间两两比较P＜0.008被认为差异具有统计学意义。　　结果：　　1.初次流产组与复发性流产组胚胎染色体异常率为60.81％(453/745)&60.47％(468/774),比较差异无统计学意义(P＞0.05),进一步比较两组胚胎不同类型染色体异常发生率差异均无统计学意义(P＞0.05)。　　2.在361对因胚胎遗传学异常行夫妻染色体核型检测患者中，与初次流产组相比，复发性流产组夫妻染色体异常率可见增高8.33％(14/168)&4.66％(9/193),但两组比较差异无统计学意义(P＞0.05),以夫妻一方存在平衡易位最常见占91.30％(21/23)。　　3.对胚胎染色体异常与夫妻染色体异常相关性进行分析，在361对因胚胎遗传学异常行夫妻染色体核型检测患者中，胚胎染色体非整倍体229例，多倍体47例，致病性CNVs58例，嵌合体27例。胚胎发生染色体非整倍体其夫妻染色体异常检出率为3.06％(7/229),胚胎D、G组非整倍体异常检出夫妻染色体异常率高于非D、G组，差异有统计学意义(P＜0.05);胚胎发生染色体致病性CNVs其夫妻染色体异常率为27.59％(16/58),各条染色体检出夫妻染色体异常率比较差异无统计学意义(P＞0.05);胚胎发生染色体多倍体及嵌合体者，未见夫妻染色体异常检出。　　4.对自然流产患者行遗传学检测方案的研究，以所有胚胎染色体异常行夫妻染色体核型检测结果作为对照，当胚胎发生染色体非整倍体时行夫妻染色体核型检测(方案一)，能检出夫妻存在遗传学异常的灵敏度为30.43％,特异度为100％,其ROC曲线下面积为0.652(95％CI:0.514-0.790);当胚胎发生D、G组染色体非整倍体及致病性CNVs时行夫妻染色体核型检测(方案二)，能检出夫妻存在遗传学异常的灵敏度为95.65％,特异度为100％,其ROC曲线下面积为0.9